HPLC法测定吡咯喹啉醌(PQQ)中咪唑并吡咯喹啉(IPQ)的含量

吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，法测PQQ)是定吡的含一种区别于烟酰胺核苷酸(NAD⁺以及NADP⁺)以及黄素核苷酸(FAD以及FMN)的新有机辅酶，上世纪60年月在钻研非磷酸化细菌的咯喹咯喹葡萄糖代谢历程中被初次发现。从微生物到人体机关，啉醌啉I量PQQ在人造界的咪唑扩散畛域极广。动物以及人类经由饮食蹊径获取PQQ以知足机体需要。并吡PQQ具备极其特意的法测理化性子，其匆匆愿望、定吡的含抗应激以及在动动物发育孳生方面的咯喹咯喹营养浸染越来越受到重视。当初对于PQQ主成份的啉醌啉I量含量测定方式较多，但测定PQQ中杂质的咪唑方式鲜有报道，本文经由试验钻研建树了HPLC法测定PQQ中咪唑并吡咯喹啉(IPQ)杂质含量的并吡方式。

一、法测资料与方式

一、定吡的含仪器与资料

Agilent1260型功能液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；METTLER-TOLEDOXS205DU型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；乙腈(上海星可高纯试剂有限公司)；磷酸氢二钾(国药总体化学试剂有限公司)；四丁基溴化铵(阿拉丁)；磷酸(ScharlabS.L)；PQQ及IPQ比力品为自制；PQQ样品为自制(批号为1790一、咯喹咯喹1790二、17903)。

二、色谱条件

TCIKaseisorbLCODS2000色谱柱(4.6妹妹×150妹妹，5lxm)；行动相为乙腈-缓冲溶液(配制10妹妹ol的磷酸氢二钾以及15妹妹ol的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调节pH至7.4)[28:72]；紫外检测器，检测波长为259nm；流速为1.0mL／min；进样量为20μL。

三、溶液配制

比力品溶液：详尽称取PQQ比力品过多，用稀释剂(乙腈-水=[1:3])定量稀释制成每一lmL中约PQQ 0.1μg的溶液。供试品溶液：详尽称取PQQ样品过多，用稀释剂定量稀释制成每一lmL中约PQQ 0.1mg的溶液。

四、检测方式

取比力品溶液与供试品溶液各20μL，分说注入液相色谱仪，记实色谱图，以峰面积按外标法合计供试品中IPQ的含量。

二、服从与品评辩说

一、专属性试验

取空缺溶液、比力品溶液以及搅浑溶液进样并记实色谱图，并用tPQ比力品溶液遏制定位；判断出峰挨次与别离度，PQQ于IPQ之间的别离度为3.1，大于1.5，空缺溶液无干扰。空缺溶液图谱见图1，比力品溶液图谱见图2，搅浑溶液图谱见图3。

二、检测灵便度试验

详尽称取IPQ比力品过多，用稀释剂消融并逐级定量稀释，测试IPQ峰的信噪比，判断检测限以及定量限，试验服从见表1，检测限图谱见图4，定量限图谱见图5。制定PQQ中IPQ的限度为不大于0.1％，本文综合检测限与定量限的服从抉择0.05％为陈说水平。
 

三、详尽度试验

0.10％以及0.15％水平退出IPQ，每一个浓度依法平取对于立比力品溶液，陆续进样6次，记实色谱图，服从比力品溶液种主峰面积的RSD为1.4％，表明仪器详尽度优异。取对于立批样品，依法平行操作制备6份供试品溶液，分说测定，服从均未检出IeQ。取对于立批样品，分说在0.05％、0.10％以及0.15％水平退出IPQ，每一个浓度依法平行操作制备3份加标溶液，分说测定，服从9份加样接管率的RSD为3.2％，表明方式重复性优异。区别合成员运用差此外仪器对于对于立批样品妨碍测定，服从不同，表明方式中间详尽度优异。

四、规范曲线的绘制以及线性关连的审核

配制IPQ浓度分说为0.0五、0.0八、0.一、0.1五、0.2μg／mL的溶液，分说进样并记实色谱图，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标妨碍线性回归，合计线性方程以及关连系数，患上到线性方程为Y=77.7168X+0.042976，线性关连系数为0.99976，服从表明IPQ在线性畛域内与峰面积呈优异的线性关连。

五、加样接管率试验

分说在供试品中退出规定浓度的0.05％、0.10％以及0.15％水平的IPQ，依法解决并测定，合计加样接管率，服从见表2。服从表明该方式具备较好的精确度。

六、溶液晃动性试验

配制比力品溶液以及供试品溶液，分说室温部署12h、24h、36h落伍样检测，部署后与0h检测服从比照，比力品溶液PQQ峰面积变换均不大于4.0％，供试品溶液测定服从不同，表明溶液在36h内晃动。

七、耐用性试验

分说改动测试条件，如改动行动相中有机相的比例、行动相中缓冲溶液的pH、柱温及流速，依法测定，服从与规范条件下测定服从不同，表明本方式具备优异的耐用性。

八、样品含量测定

取PQQ样品，依法测定，服从均未检出IPQ，表明产物均适宜制定品质指标要求，详尽见表3。

在方式建树历程中，思考到IPQ杂质相干于PQQ产物的制备老本会高良多，对于IPQ相干于PQQ的相对于响应因子(RRF)妨碍了测试，服从为1.089，介于0.9～1.1之间，因此接管PQQ作为外标法合计的比力品，大大削减了IPQ杂质比力品的用量。

三、论断

方式学验证表明，建树的HPLC法测定PQQ中IPQ含量的方式，具备优异的专属性、检测灵便度、详尽度、线性以及精确度，方式较为啰嗦，精确坚贞，可能比照好地操作产品质量，易于奉背运用，适用于PQQ中IPQ的品质操作。

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