赭曲霉毒素A规范检测方式（二）

二、赭曲薄层色谱测定

(1)薄层板的霉毒制备：称取4g硅胶G，加约10mL水于乳钵中研磨至糊状，规范赶快倒入涂布器内，检测制成5cm×20cm、赭曲厚度O.3min的霉毒薄层板三块，在空气中去世板后，规范在105～110℃活化1h，检测掏出放去世板器中保存。赭曲

(2)点样：取两块薄层板，霉毒在距薄层板下端2.5cm的规范基线上用微量注射器滴加两个点。在距板左侧缘1.7cm处滴加0TA规范溶液8μL(浓度O.5μg／mL)，检测在距板左侧缘2.5cm处滴加样液25μL，赭曲而后在第二块板的霉毒样液点上加滴0TA规范溶液8μL(浓度O.5μg/mL)。

(3)睁开

①睁开剂

横展剂：乙醚或者乙醚-甲醇-水(94+5+1)。规范

纵展剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6+3+1.2+O.06)或者甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6+3+1.4)，苯-冰乙酸(9+1)。

②横向睁开：在睁开槽内倒入10mL横展剂，先将薄层板纵展至离原点2～3cm，掏出透风挥发溶剂l～2 min后，再将该薄层板靠规范点的长边置于对于立睁开槽内的溶剂中横展，如横展剂不够，可削减过多，展至板端过1min，掏出透风挥发溶剂2～3min。

③纵向睁开：在另一睁开槽内倒入lOmL纵展剂，将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点13～15cm。掏出，透风挥干至板面无酸味(约5～10min)。

(4)审核与评定：将薄层色谱板置波长365nm紫外光灯下审核。

①在紫外光灯下将两板相互比照，若第二块板的样液点在OTA规范点的响应处泛起最低检出量，而在第一块板相同位置上未泛起荧光点，则样品中的OTA含量在测定方式的灵便度10μg/kg如下。

②假如第一板样液点在与第二板样液点相同位置上泛起荧光点，则看第二板样液的荧光点是否与滴加的规范荧光点重叠，再妨碍如下的定量与确证试验。

(5)稀释定量

对于仍是液中OTA与规范OTA的荧光强度，预计稀释倍数。经稀释后测定含量时，可在样液点的左侧基线上滴加二个规范点，0TA的量可为4ng、8ng。对于仍是液与两个规范OTA荧光点的荧光强度，概况定量。

(6)确证试验：用碳酸氢钠乙醇溶液(在100mL水中消融6.0g碳酸氢钠，加20mL乙醇)喷洒薄层色谱板，在室温下去世板，于长波紫外光灯下审核，这时OTA荧光点应由黄绿色酿成蓝色，而且荧光强度有所削减，再预计样品中OTA，假如与喷洒前状态不不同，要运用喷洒前所做的预计。

(六)留意事变

一、空气湿度影响薄层板别离成果，可依据板面别离状态决定纵展剂中是否加水。

二、假如将薄层板间接妨碍横展，当样品中OTA含量高时，OTA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或者分成两个黄绿色荧光点。这是因为在横展历程中原点上样品的量超过了硅胶的吸附能耐，原点上的杂质以及残留溶剂在横展中将OTA点横向拉长了，这时可依据OTA黄绿色荧光的总强度与规范荧光强度比照，预计需削减的滴加微升数或者所需稀释倍数。在本方式中，先将薄层板纵展一短距离后再横展，防御了上述征兆的发生。

三、OTA的规范运用液应避光，用黑纸遮光。

四、在薄层板上OTA的最低检出量为4μg，本方式的最低检丈量为10μg/kg。

五、本方式经五个相助者验证，当小麦、玉米中OTA退出量分说为十、50、100μg／kg水平、每一个水平n=2时，方式的接管率用X呈现，详尽度用SD呈现：

小麦分说为93±10.2三、92±14.7二、105±38.85；

玉米分说为88±9.6八、88±9.6八、103±41.2。

二、酶联免疫吸附测定法

用赭曲霉毒素A作为半抗原，与牛血无辜卵白(BSA)某人&ga妹妹a;球卵白散漫，制成复合抗原；免疫动物，产生特同性的抗血清或者单克隆抗体，并建树起酶联免疫吸附测定法。Candlish等人1986年初次报道了抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体。卫生部食物卫生监督魔难所也已经制备出高特同性的抗赭曲霉毒素单克隆抗体，建树了间接相助性酶联免疫吸附测定法(间接法)以及间接相助性酶联免疫吸附测定法(间接法)。

(一)间接法

一、道理：将已经知抗原吸附在固相载体外表，洗除了未吸附的抗原，退出未必量的酶符号抗体与样品(含有抗原)提取液的搅浑液，相助温育后，在固相载体外表组成抗原-抗体-酶复合物。洗除了过剩全副，退出酶的底物。在酶的催化浸染下，底物发生降解反映，产生有色物资。经由酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。

参考资料：食物卫生微生物魔难规范手册

相干链接：乙酸乙酯，碳酸氢钠，赭曲霉毒素A