红肉火龙果采后品质劣变及苹果酸代谢钻研（一）

火龙果属仙人掌科三角柱属，红肉火龙后品原产于墨西哥、果采中美洲以及南美洲，质劣因其瘦弱特色以及营养价格受到重视而被宽泛种植。变及当初，苹果市面上罕有的酸代火龙果种类主要有：白肉火龙果、红肉火龙果以及紫红肉火龙果3种。谢钻其中，红肉火龙后品红肉火龙果果肉中富含白肉火龙果所贫乏的果采甜菜色素，还含有充实的质劣不饱以及脂肪酸、水溶性食物纤维等。变及除了有较高的苹果营养价格外，红肉火龙果在抗氧化方面临人体也有未必的酸代辅助浸染。

果实中有机酸的谢钻组成与含量是影响果实风韵品质的严主因素。果实中存在良多种类的红肉火龙后品有机酸，可是大少数果实个别以1种有机酸为主，少数以多种为主。依据主要有机酸的种类，可能将果实分为苹果酸型果实、柠檬酸型果实以及酒石酸型果实等。果实中的有机酸代谢是一个重大的心理历程，由有机酸的分解以及降解配合决定。有钻研表明，苹果酸是火龙果的主要有机酸。苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)以及苹果酸酶(NADP-ME)是苹果酸代谢中紧张的3个酶，前两者催化苹果酸的分解，后者则退出苹果酸的降解，它们配合调节了火龙果愿望发育历程中苹果酸的代谢以及积攒，其含量是一个动态变换的历程，可影响火龙果的风韵品质。

当初对于红肉火龙果中苹果酸的代谢变换还未见钻研报道。本试验钻研了“玫瑰香”种类以及“大红一号”种类火龙果蕴藏历程中的质质变换以及苹果酸代谢紧张基因NADP-ME、PEPC以及NAD-MDH的表白差距，为进一步钻研红肉火龙果采后蕴藏历程中苹果酸积攒的调控机制以及对于风韵特色组成的影响提供迷信依据。

1 资料与方式

1.1 资料与试剂

1.1.1 资料

“玫瑰香”种类火龙果，采自浙江省山河市秋实家庭农场；“大红一号”种类火龙果，采自浙江省诸暨市雪锋火龙果基地，保鲜车运回试验室后置于10℃冷库中预冷12h。

1.1.2 试剂

磷酸二氢钾、磷酸、福林-酚等(合成纯级)，购自国药总体化学试剂有限公司；色谱级甲醇、色谱级乙腈，购自美国迪马科技公司；草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、富马酸及琥珀酸规范品，购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；异硫氰酸苯酯、三乙胺、游离氨基酸混标，购于美国Sigma试剂公司：PEPC测定试剂盒。购于南京建成生物工程钻研所。

1.2 仪器与配置装备部署

TAXTPlus型质构仪，英国SMS公司：PAL-1型手持折射仪，日本ATAG0公司；877Titrinoplus被动电位滴定仪，瑞士万通股份有限公司；UV-9000紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司：Waters功能液相色谱仪(型号e2695-2998配有PDA检测器)，沃特世科技(上海)有限公司；微量分光光度计，日本SHIMADZY公司；恒温扩增PCR仪，美国赛默飞世尔科技公司：微量核算卵白测定仪，美国赛默飞世尔科技公司：The瑚oMR23i高速高温冷冻离神思。法国捷安特总体股份有限公司。

1.3 试验方式

筛选有机械伤害，果实巨细以及成熟度相对于不同的“玫瑰香”火龙果以及“大红一号”火龙果。用2％次氯酸钠浸泡消毒后人造晾干，于25℃恒温作育，每一组3次重复。分说在蕴藏第0，1，2，3，4，5，6。7，8天定期取样，置于液氮中迅速冻存，搅浑后分装至样品袋中，于-80℃保存。用于后续品质指标测定。

1.3.1 硬度的测定

参考黄子娟的方式。并稍作更正。接管质构仪测定火龙果的果皮硬度以及果肉硬度，运用直径2妹妹探头(P/2型)，选取火龙果果实无鳞片的赤道部位妨碍穿刺测定，重复3次，取平均值，单元为N。

1.3.2 可滴定酸含量的测定

接管可滴定酸被动电位滴定仪测定。果肉匀浆后过滤，取滤液1mL，用去离子水定容至100mL。以0.05mol/LNa0H溶液滴定，记实滴定尽头时所用碱溶液的体积，并合计可滴定酸含量，重复3次。

1.3.3 可溶性固形物含量的测

接管手持折射仪测定样品可溶性固形物含量，重复3次。

1.3.4 维生素C含量的测定

参考吴媛媛等的方式。称取1g火龙果研磨样，退出5％TCA溶液，混匀后离心。取上清液挨次退出5％三氯乙酸、0.5％邻菲罗琳-乙醇溶液、0.5％磷酸-乙醇溶液、0.03％三氯化铁-乙醇溶液以及1mL无水乙醇后于30℃水浴1h。用蒸馏水调零，以蒸馏水替换上清液为参比。在波长534nm处测定吸光度值，重复3次，单元为mg/100g。

1.3.5 总酚含量的测定

接享福林酚比色法，参考范智义等的方式，并作适量更正。称取火龙果研磨样1.0g，退出5.OmL60％乙醇浸提2h，10000×g离心15min，取上清液1mL至25mL具塞试管中，退出3mL1.0mol/L福林酚试剂后摇匀，静置5min后退出6mL7.5％碳酸钠，用蒸馏水定容至25mL。室温下在暗处部署2h，以不加没食子酸的样品为空缺，于波长760nm处测定其吸光度值，重复3次，以没食子酸含量为规范物测定总酚含量，单元为μg/g。

1.3.6 可溶性糖含量的测定

参考曹瘦弱等的苯酚一硫酸法，并作适量更正。称取火龙果研磨样1.0g，退出5。10mL蒸馏水后封口，于100℃水浴30min。冷却后过滤。滤液移入100mL容量瓶，接管残渣，退出5～10mL蒸馏水于100℃水浴10min后冷却、过滤，并吞滤液。取500μL样品液于试管中。退出1.5mL蒸馏水以及1.0mL9％苯酚，摇匀，在5～20s内退出5mL浓硫酸，摇匀，室温下反映30min，以空缺为参比，在波长485nm处测定其吸光度值，重复3次。

1.3.7 有机酸组分的测定

1) 色谱条件

C18反相色谱柱(3.9妹妹×300妹妹，5μm)；柱温30℃；行动相为0.04mg/LKH2PO4-H3P04缓冲溶液：甲醇=95:5(体积比)；流速0.8mL/min；进样体积10μL；配有PDA检测器，检测波长214nm；外标法定量。

2) 提取方式

勤勉用液相色谱法，参考关秀杰等的方式，并作适量更正。称取火龙果研磨样5.0g于10mL容量瓶，退出未必量行动相，于75℃水浴45min，冷却至室温，定容。涡旋2min，超声提取15min，过滤别离卵白质等大份子物资。取未必量滤液，离心10min后用0.45μm孔径的滤膜过滤上清液，备用。

1.3.8 NAD-MDH以及NADP-ME酶活的测定

1)酶液提取

参考Masashi等以及Hirai等的方式，稍作更正。取5g火龙果研磨样，退出10mL经预冷的研磨缓冲液(包罗10妹妹ol/L异抗坏血酸、0.6mol/L蔗糖、0.2mol，LTris-HCl，pH8.2)，高温离心后取上清液。用pH8.2的提取缓冲液(包罗10妹妹01/L异抗坏血酸、0.1％曲拉通X-100、0.2mol/LTris-HCl)定容到50mL，混匀后用提取缓冲液定容至100mL，酶液高温保存备用。

2)酶活测定

NAD-MDH以及NADP-ME酶活性测定参考Hirai等的方式。

1.3.9 PEPC酶活的测定

运用PEPC测定试剂盒测定样品中PEPC的酶活。

1.3.10 总RNA提取及检测

运用天根多糖多酚动物总RNA提取试剂盒提取火龙果总RNA。取1μLRNA经由核酸卵白测定仪测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值魔难RNA纯度，用平凡琼脂糖凝胶电泳魔难RNA残缺性。

1.3.11 RT-qPCR合成

以总RNA为模版，接管诺维赞反转录试剂盒，在冰浴条件下妨碍第1链cDNA的分解。

苹果酸代谢相干基因引物(表1)经由Primer软件自主妄想，魔难引物熔解曲线繁多(无特同性产物)后，可用于实时荧光定量合成。

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