传统发酵豆腐酸浆中高产酸乳酸菌的别离判断及特色合成（一）

酸浆豆腐是传统产酸成我国特色的传统食物，其制作的发酵特意之处在于用酸浆替换传统的盐卤以及石膏作为凝聚剂。酸浆豆腐不断依靠工人多年履历妨碍斲丧的豆腐小作坊制作方式，先将酸浆老汤退出黄浆水，酸浆色合其中的中高乳酸菌在常温下将黄浆水人造发酵为酸浆，再运用酸浆作为酸性凝聚剂，乳酸经由点浆使豆乳凝聚制成酸浆豆腐。菌的及特酸浆豆腐口感详尽，别离风韵特意，判断在我国山东等地曾经作为特色食物被参加“非物资文化遗产”。传统产酸成可是发酵手使命坊式的斲丧方式具备酸浆品质无奈保障，斲丧功能低，豆腐货架期不晃动等弱点。酸浆色合为了实现酸浆豆腐的中高工业化斲丧，增长我国传统食物的乳酸“食文化”宽泛转达，对于酸浆中的乳酸菌妨碍别离筛选，发掘产酸能耐强的菌株井探究其性子，为日后酸浆豆腐的工业化斲丧打下根基。

全副学者对于豆腐酸浆中的微生物睁开了开始探究，乔支红等运用从豆腐酸浆老汤中筛选到的5株产酸菌发酵大豆黄浆水，以酸浆的pH值为审核指标，品评辩说了单菌发酵、双菌发酵、发酵温度、菌种接种量及菌种的搅浑比例对于酸浆pH值的影响，服从表明，酸浆纯种发酵的最佳工艺参数为双菌搅浑发酵，搅浑比例1∶9（1号菌∶3号菌），接种量5%，发酵光阴24h，发酵温度42℃；贺云等从云南牟定区域的10份人造发酵酸浆豆腐中别离筛选患上到6种乳酸菌，并分说判断为类布氏乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、动物乳杆菌、德式乳杆菌以及粘膜乳杆菌，其中动物乳杆菌产酸能耐最强；刘倩等从豆清发酵液中别离纯化出3株产酸菌，经心理生化以及16SrRNA基因序列合成判断该菌株为产酸解淀粉乳杆菌。但现有钻研规模于繁多产地，缺少对于天下酸浆菌种差距的部份钻研。

本钻研从云南建水、陕西榆林、山东邹平、河北涞源、云南石屏以及北京延庆6个国内具备代表性的酸浆豆腐产地中的7种豆腐酸浆老汤中筛选别离百般品中的高产酸乳酸菌，经由形态审核及份子生物学技术妨碍判断，并对于其产酸能耐、耐酸性、耐盐性等愿望特色妨碍钻研，旨在对于天下主要酸浆豆腐产地中的产酸菌组成及特色妨碍探究，为酸浆中低劣乳酸菌生物资源的筛选以及后续酸浆斲丧工业化奠基根基、提供迷信依据。

一、资料与方式

一、资料与试剂

（1）资料

豆腐酸浆老汤：云南建水、陕西榆林、山东邹平、河北涞源、云南石屏以及北京延庆的酸浆豆腐加使命坊。

（2）作育基

黄浆水作育基：为豆腐压滤成型后的黄色沥水，取自北京延庆豆腐厂。MRS肉汤作育基、MRS固体作育基：北京奥博星生物技术有限责任公司。以上作育基在121℃条件下低压蒸汽灭菌20min。

（3）化学试剂

葡萄糖、无水碳酸钙、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠（均为合成纯）：国药总体化学试剂有限公司；二甲基亚砜（色谱纯）：北京博奥拓达公司；细菌基因组脱氧核糖核酸提取试剂盒、接管试剂盒、DL3000DNAMarker、TransTaq-TDNAPoly-merase（250U）、10×TransTaq-TBuffer、2.5妹妹ol／L脱氧核糖核苷三磷酸、6×DNALoadingBuffer：美国TransTaq公司。

二、仪器与配置装备部署

YP20001电子大平：上海雷韵试验仪器制作有限公司；PHS-3CpH计：匕海详尽迷信仪器有限公司；DL-CJ-2ND型超净使命台：北京东联哈尔仪器制作有限公司；YQX-SG46-280S被动低压灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗配置装备部署厂；TENSUC恒温作育箱：匕海大呈试验仪器制作有限公司；TU-1900紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-16aR高速冷冻离神思：上海安亭迷信仪器厂；1260series功能液相色谱仪：美国Agilent科技有限公司；T1000聚合酶链式反映仪：美国Bio-Rad公司。

三、试验方式

（1）酸浆增殖作育

酸浆的活化与增殖作育接管乔支红等的方式。取5mL酸浆接种于20mL黄浆水作育基中，在37℃恒温作育箱中静置作育48h。

（2）产酸菌株的别离纯化

将增殖作育的酸浆经无菌心理盐水梯度稀释至10^-4、10^-5、10^-6三个梯度，取100μL梯度稀释液于空缺作育皿中，倒入消融井冷却至45℃左右的含有2%CaCO3的MRS肉汤作育基，于37℃恒温作育箱中颠倒作育48h。挑取产生溶钙圈的菌落于MRS固体作育基重复划线别离直至泛起单菌落，镜检后选取适宜乳酸菌形态、无杂菌的菌落接种于MRS斜面作育基于4℃保存。

（3）高产酸菌株的筛选

将每一个样品中别离纯化患上到的乳酸菌活化后接种于MRS肉汤作育基中，37℃恒温静置作育24h，测定作育基pH值，选取每一个样品中pH值最低的菌株为该样品中高产酸菌株。

（4）菌株的份子生物学判断

接管细菌基因组DNA提取试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA，以其为模板对于菌株的16SrDNA妨碍PCR扩增。PCR扩增引物为16SrDNA通用引物1492R、27F；PCR扩增系统：10×buffer5μL，10×TransTaq-T0.5μL，引物27F1μL，引物1492R1μL，DNA模板1μL，dNTPs4μL。PCR扩增挨次：预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃缩短1min，29个循环；72℃再缩短10min，4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片断。将PCR扩增产物用接管试剂盒接管，运用测序仪对于PCR扩增产物妨碍测序。

将测序服从提交至美国国立生物技术信息中间的Genbank数据库中妨碍根基全副比对于搜查工具比对于，选取同源性较高的模式菌株的16SrDNA序列，接管MEGA-X10.1软件中的毗邻法构建系统发育树。

（5）产酸量测定

将活化后的菌种按2%（V／V）的接种量接种于MRS肉汤作育基中，37℃恒温静置作育。取样光阴距离为前12h每一隔2h取样测定；12h后每一隔4h取样测定；24h后每一隔12h取样测定。发酵液经蒸馏水稀释10倍后，滴加5滴酚酞溶液，用0.1mol／L氢氧化钠溶液滴定至粉红色泛起，且30s后不褪色即为滴定尽头，记实NaOH斲丧体积，三组平行。以灭菌后的MRS肉汤作育基作为空缺比力，合计产酸量，其合计公式如下：

X=（V₁-V₂）×C_NaOH×0.09×100／V_样品X为样品产酸量（以乳酸计），g／100mL；V₁为样品斲丧氢氧化钠溶液体积，mL；V₂为空缺作育基斲丧氢氧化钠溶液体积，mL；C_NaOH为标定的氢氧化钠浓度，g／L；0.09为乳酸的换算系数。

（6）有机酸组成合成

将活化后的菌种接种于MRS肉汤作育基中，37℃恒温静置作育12h。接管功能液相色谱（HPLC）妨碍有机酸组成合成。液相色谱条件：色谱柱为CarbomixH-NP10：8%（10μm，7.8×300妹妹）；行动相为20妹妹ol／LNaH2PO4；进样体积为10μL；流速为1.0mL／min；柱温为30℃；检测波长为210nm。

（7）耐酸性测定

以人造pH值的MRS肉汤作育基（pH6.83）作为空缺比力，将预先活化好的菌株按2%（V／V）的接种量分说接种于pH值为1.五、2.0、2.五、3.0、3.五、4.0、4.五、5.0的作育基中，37℃静置作育48h，接管分光光度计在波长600nm处测定其OD_600nm值。

（8）耐盐性测定

将预先活化好的菌株按2%（V／V）的接种量接种于盐浓度分说为0、1%、2%、3%、4%、5%的MRS肉汤作育基中，37℃静置作育48h，测定其OD_600nm值。

（9）数据解决

运用Excel与SPSS18.0软件对于数据妨碍合成解决，运用MEGA-X10.1软件构建系统发育树。

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