谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表白及运用（一）

&ga妹妹a;-氨基丁酸(GABA)是谷氨杆菌一种四碳非卵白质氨基酸，是酸脱羧酶由谷氨酸脱羧酶不可逆、专一地将L-谷氨酸的枯草α-羧基脱去-份子CO₂患上到，是芽孢用高度溶于水的两性离子，pK值为4.03以及10.56，表白因此呈现出与该类氨基酸相似的及运心理活性，即作为一种抑制性神经递质存在于哺乳动物的谷氨杆菌中枢神经系统中。当初宽泛运用于工业、酸脱羧酶动物饲料、枯草医药以及食物行业。芽孢用

少许钻研表明，表白GABA有增长就寝、及运增强影像力、谷氨杆菌抗焦虑、酸脱羧酶防御以及治疗癫痫、枯草延缓脑朽迈、舒缓血管、调节激素渗透、普及受精率、破除了氨毒、增强肝功能等浸染。

当初制备GABA的方式主要有动物富集法、化学分解法、微生物发酵法、酶催化法。动物富集法斲丧GABA尽管牢靠环保，但GABA浓度低，尚未法用作药物、食物削减剂；化学分解法斲丧GABA牢靠性较差、有化学残留，也不易达到医药及食物行业的规范：微生物发酵法患上到的GABA是一个多相重大系统，浓度低，鄙俚产物别离老本高，是斲丧高纯度、高浓度GABA的一个瓶颈成果。以是，当初制备GABA多接管酶催化法，主若是运用微生物细胞内别离患上到的谷氨酸脱羧酶或者可能斲丧谷氨酸脱羧酶的微生物细胞专一、不可逆地脱去L-谷氨酸的α-羧基，从而患上到高浓度、高纯度的GABA。此方式的短处是反映条件以及顺、不需要高尚的质料、能耗低，而且微生物源头的谷氨酸脱羧酶以及可能斲丧谷氨酸脱羧酶的微生物细胞可经由重大的细胞作育少许获取。

当初大多钻研以大肠杆菌为宿主表白GAD，催化斲丧GABA。在重组菌发酵历程中削减未必浓度的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)可能增长GAD的折叠，从而普及GAD酶精力。除了此之外，酶催化法即运用GAD将谷氨酸脱去一份子CO₂制备GABA历程中，在酶转化系统中削减未必量的PLP可能增长酶液或者全细胞的转化旧。有钻研者报道了在大肠杆菌发酵历程中间接削减0.02妹妹ol/LPLP后，GABA产量是比力的2.0～2.5倍。可是PLP价格高尚，在发酵历程以及酶转化系统中间接削减无疑大大削减斲丧老本。因为大肠杆菌自身具备吡哆醛激酶(PdxK)基因以及磷酸吡哆醇氧化酶(PdxH)基因，从而组成PLP填补蹊径(见图1)。辅酶前体吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)以及吡哆醛(PL)上57羟甲基经由PdxK使其磷酸化，天生对于应的辅酶中问体磷酸吡哆醇(PNP)以及磷酸吡哆胺(PMP)以及辅酶磷酸吡哆醛(PLP)，PdxH进一步催化PNP或者PMP的氧化反映，天生辅酶PLP，辅酶PLP的削减可增长GAD的折叠，普及GAD酶精力。黄燕等钻研了在大肠杆菌发酵历程中削减PN后，酶活是比力组(不削减PN)的1.8倍。

可是大肠杆菌为非食物牢靠菌株，在发酵历程中易产生内毒素，而且需要削减价格高尚且有危害浸染的IPTG作为诱导剂诱导产酶，其斲丢患上到的GAD牢靠性不高，距离知足食物以及医药畛域的要求尚有未必差距。枯草芽孢杆菌是经由美国食物以及药物打点局GARS认证的牢靠菌株，宽泛运用在食物、医药斲丧中。可是在枯草芽孢杆菌中贫乏PdxH，以是无奈运用削减辅酶前体PN的方式，经由PLP填补蹊径将PN转化为PLP，从而普及GAD酶精力。当初，少许的钻研会集在以枯草芽孢杆菌为宿主斲丧GAD，在酶转化历程中经由间接削减辅酶PLP普及转化功能，如丁伟等运用牢靠宿主枯草芽孢杆菌斲丧GABA，在其转化历程巾间接削减PLP，全细胞催化GABA产量为239.91g/L，转化率54.48％。因为PLP价格高尚，导致斲丧老本较高，无奈适应工业化斲丧需要。对于在枯草芽孢杆菌为宿主斲丧GAD发酵历程中，削减价格高尚的辅酶前体以普及GAD酶精力的钻研未见报道。因此作者以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为宿主，经由基因工程将大肠杆菌源头的谷氨酸脱羧酶基因(gadB)在B.sMbtilis中异源表白，削减相对于自制的辅酶前体PL，经由PdxK介导的PLP填补蹊径将其转化天生PLP(见图2)，从而普及酶活以及产量，着落斲丧老本。

1 资料与方式

1.1 资料

1.1.1 菌株以及质粒

质粒EcoliJMl09/pET-24a(+)-gadB为作者地址试验室前期构建，菌株B.5Mbtilis以及表白载体pHY300PLK(含启动子P_HfpaH以及P_armyQ，不含信号肽)由作者地址试验室保存。

1.1.2 作育基

LB液体作育基(g/L)：分说称取氯化钠10g、酵母粉5g、卵白胨10g，溶于1L去离子水中，并经由削减2mol/LNaOH或者HCl调节pH至7.0。

LB固体琼脂作育基：LB液体作育基中削减品质浓度为20g/L的琼脂粉。

高渗液体作育基：LB液体作育基巾削减0.5mol/L山梨醇。

电转作育基：LB液体作育基中分说削减0.5mol/L山梨醇以及甘露醇，品质浓度为100g/L的葡萄糖。

RM作育基：LB液体作育基中削减0.5mol/L山梨醇以及0.38mol/L甘露醇。

TB作育基(g/L)：分说称取酵母粉24g、卵白胨12g、甘油5g、三水磷酸氢二钾16.43g、磷酸二氢钾2.31g，溶于1L去离子水中，并削减2mol/LNaOH或者HCl调节pH至7.0。

1.1.3 试剂

pH至7.0。1.1.3试剂QuickcutHindⅢ限度性内切酶：购自TaKaRa生物医药技术有限公司；2xphantaMaxMasterMix、ExnaseⅡ无缝衔接试剂盒：购自诺唯赞(南京)生物科技有限公司；DL-10000DNAMarker、氨苄青霉素、四环素：购白宝生物有限公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA同收试剂盒：购日间根生化科技(北京)有限公司

UnstainedProteinMWMarker规范卵白品、卵白胶制备试剂盒：购自碧云天生物技术有限公司：份子级的卵白胨以及酵母粉：购自英国Oxiod公司：其余老例试剂：购自国药化学试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器

PCR仪：购自美国Bio-Rad公司：722型紫外可见分光光度计：购白上海仪电合成仪器有限公司：冷冻式离神思：购自Beckmancoulter公司：KQ-250E型超声波细胞破碎捣毁机：购自宁波新芝生物科技股份有限公司；pH计：购自瑞士Mettler-Toledo公司：功能液相色谱仪：购自安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方式

1.2.1 引物妄想

以质粒pET-24a(+)-gadB为模板，依据无缝克隆同源臂妄想原则分说妄想正、反向引物：正向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反向引物(R1)：5'-‘ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3’。

以质粒载体pHY300PLK为模板，依据无缝克隆同源臂妄想原则分说妄想正、反向引物：
正向引物(F2)：5'-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAATG-3’：反向引物(R2)：5’-GGTGTTTTTTTACCAAGCTT-3’。
将妄想好的引物送至苏州金唯智生物科技有限公司分解。

1.2.2 指标基因以及表白载体的获取

以试验室保存的质粒pET-24a(+)-gadB为模板，F1/R1为正反向引物扩增gadB指标基因；PCR反映系统(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂034μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL，正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR挨次：94℃预变性5min，98℃变性10S，55℃退火5S。72℃缩短2min，变性至缩短历程妨碍29个循环：72℃缩短10min；4℃保存。

以质粒载体pHY300PLK为模板，F2/R2为正反向引物扩增表白载体；PCR反映系统(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂O34μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL,正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR挨次：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火5S，72℃缩短6min，变性至缩短历程妨碍29个循环：72℃缩短10min；4℃保存。

指标基因以及表白载体PCR条带经由琼脂糖核酸电泳妨碍验证。

1.2.3 指标基因以及表白载体的衔接与判断

1.2.2已经验证精确的PCR产物经由琼脂糖凝胶同收试剂盒妨碍接管。接管后的PCR产物用ExnaseⅡ衔接酶衔接，其衔接系统如下：ddH₂O5.3μL、5×CEBuffer2μL、ExnaseⅡ1μL、表白载体1.16μL、指标基因0.54μL，置于PCR仪37℃反映30min实现衔接。

接管大肠杆菌JMl09热击转化法后，将转化细胞液涂布至含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体作育基上，在37℃恒温作育箱颠倒作育10～12h，挑取单菌落至含100μg/mL氨苄青霉素的10mLLB液体作育基中，置于恒温摇床37℃、200r/min作育8～10h后收集菌体，并提取质粒以便验证以及妨碍后续试验。将提取的质粒妨碍HindⅢ酶切验证精确后送往苏州金唯智生物科技有限公司测序。将测序精确的质粒经由电击转化法导入表白宿主B.Subtilis中，将转化细胞液涂布至含20μg/mL四环素的LB同体作育基上，在37℃恒温作育箱颠倒作育10～12h，挑取单菌落至含20μg/mL四环素的10mLLB液体作育基中，置于恒温摇床37℃、200r/min作育8～10h后收集菌体，并提取质粒妨碍酶切验证。

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