氨基甲酸乙酯降解酶的牢靠化钻研（一）

牢靠化生物技术是氨基使水溶性的细胞/酶与水不溶载体在物理或者化学方式的浸染下成为水不溶性细胞/酶的一类技术。酶同定化技术是甲酸降解用同体资料将游离的酶解放或者限度于未必区域，但仍具备催化活性并可重复运用的乙酯研一种技术，其短处是牢靠：1)与游离酶比照，酶晃动性更高：2)可重复运用，化钻节约资源；3)易于从指标物巾完因素袂；4)酶活性保存时问长：5)环保，氨基对于产物的甲酸降解影响较小。但也存在如下多少点缺少：对于同定化技术要求高，乙酯研削减老本；制备历程酶活受影响：牢靠化酶的牢靠成果受多种因素影响因此存在较大差距。

自1910年酶的化钻牢靠化钻研开始，酶的氨基牢靠化技术也患上到了很好的发展，特意是甲酸降解酶的牢靠化新型载体层出不穷。人们常依据差此外运用需要抉择差此外同定化载体，乙酯研不光要求它的牢靠同定化功能好。好比食物畛域就要求高牢靠功能、化钻无传染性、经济适用性等。依据牢靠化载体的组成成份可将其根基分为如下3大类：有机载体(硅藻土、活性炭、多孔陶瓷、玻璃等、人造高份子资料(壳聚糖、淀粉、海藻酸钠、纤维素等以及分解有机资料(罕有的有聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、氧化石墨烯等。依据酶与载体的散漫方式可将酶的牢靠化方式分为4类：吸附法是依靠带电的酶与载体之问的静电浸染，使酶吸附于载体外表上的一种方式。包埋法是将酶用物理的方式包埋在种种载体(网格或者半透膜)内，此法是当初运用至多的一种事实的牢靠化方式。交联法是借助双功能试剂使酶份子以及载体之间发生交联的一种牢靠化方式.此法牢靠的酶具备优异的晃动性，罕用的双功能试剂有戊二醛、甲醛、京尼平、双偶氮苯等。共价偶联法是借助共价键将载体的功能基团(馥郁氨基、羟基、羧甲基等)以及酶的活性非必须侧链基团(羧基、巯基、羟基、酚羟基以及咪唑基等)妨碍偶联的一种方式。

在已经有的报道中对于牢靠化酶有如下钻研：彭虹旎等以氨基多糖为资料，戊二醛为交联剂制备了外表滑腻氨基多糖微球载体以及多孔氨基多糖微球载体。以此载体对于脲酶妨碍牢靠化，服从表明：多孔微球载体的同定化功能以及同定化酶精力均高于外表滑腻微球载体，因其牢靠的酶量更多，故呈现出更高的酶精力。2015年，王简之等运用磁性复合微球对于脂肪酶妨碍牢靠化，患上到的牢靠化脂肪酶在热晃动性、酸碱耐受性、重复运用率方面有所降职。在pH4.0，共价牢靠6h后，牢靠化脂肪酶的酶活损失低于40％。有钻研者将甲基丙烯、问苯二胺水凝胶、壳聚糖以及氧化石墨烯反映制备复合股料，制患上的复合凝胶在机械强度以及吸附能耐方面都有所降职。

凝胶在机械强度以及吸附能耐方面都有所降职。同定化酶在普及食物运用率以及营养价格方面有突出贡献，好比牢靠化淀粉酶可能将淀粉分解为易被人体罗致的短链小份子糖：牢靠化脂肪酶可用于代可可脂的脱脂；而钻研较多的牢靠化脲酶已经运用于酒精饮料中尿素以及EC的去除了，可能降职发酵饮品的饮用牢靠性。为了短缺发挥脲酶的适用价格，国内外钻研者已经对于脲酶的同定化妨碍了良多探究，而直到近多少年，国内学者才逐步睁开对于EC降解酶的牢靠化钻研。赵雅敏对于筛选到的产EC降解酶的菌株LBMAE-8妨碍钻研，发现对于该菌妨碍细胞牢靠化解决，壳聚糖/海藻酸钙微胶囊一步法比海藻酸钙包埋法制患上的牢靠化细胞的酶活接管率高。张迁等未来自P.rettgeriJN-B815的酸性脲酶经乙醇积淀、离子替换等纯化后用壳聚糖微球妨碍牢靠化，制备的牢靠化酸性脲酶的温度晃动性、pH晃动性及对于黄酒中尿素以及EC的去除了率均有所降职俐。刘小锋运用氧化石墨烯(GO)以及壳聚糖(CS)复合微球对于酸性脲酶妨碍牢靠化，在流化床反映器中审核同定化酸性脲酶对于黄酒的解决成果，该酶对于黄酒中尿素的去除了率高达93.85％，而对于EC的去除了率达到57.46％。

牢靠化酶的酶精力、底物亲以及力、米氏常数、反映活化能等性子会因为酶的性子、载体资料的性子及包埋条件的区别而发生改动，因此，平凡对于载体资料以及同定化方式经由尝试试探能耐判断最佳妄想。经由筛选产EC降解酶的微生物并优化其产酶条件，从而取患上未必数目的EC降解酶并将其运用于国内酒精饮料中EC含量的着落成为当初钻研的一个热门。

作者同绕牢靠化EC降解酶的牢靠条件、酶学性子及运用睁开钻研，为保障发酵饮品的牢靠性提供事实反对于。

1 资料与方式

1.1 资料与试剂

选取经活化以及优化作育的CAT-4(Kluyvero-mycesmarxianus)酵母菌株作为登程菌株，取其发酵液经由重复冻融散漫超声破碎法患上到EC降解酶粗酶液，待用。乙醇(色谱纯)：天津致远公司产物；氨基甲酸乙酯、正丙基甲酸酯：Sigma-aldrich公司产物：其余溶剂均为合成纯。

1.2 仪器与配置装备部署

DVB/CAR/PDMS(50/30pom)SPME萃取头、7890B-5977A气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司产物：FRESCO21高速冷冻离神思：ThermoFisherScientific公司产物：AS-4S超声细胞破碎仪：宁波新芝生物技术股份有限公司产物；722型可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司产物。

1.3 方式

1.3.1 微球载体的制备及交联条件的优化

1) 滴入法制备壳聚糖微球

称取0.5g壳聚糖消融于50mL体积分数1.0％的醋酸溶液中，置于摇床上活化2h，将活化的壳聚糖用注射器逐滴退出含有品质分数20％NaOH以及体积分数30％CH3OH的凝聚液中，筛选出粒度平均、形态规整的壳聚糖微球，用去离子水洗至中性，冷藏备用。

2) 戊二醛交联壳聚糖载体的制备

将上述制备的微球置于体积分数6％戊二醛溶液巾，在30℃恒温水浴锅巾振荡6h。反映实现后，用去离子水重复洗涤，以去除了残余的戊二醛，直至洗涤液在280nm处的吸光度小于0.01，即患上戊二醛交联壳聚糖微球载体。

3) 粗酶液的制备及EC降解酶的牢靠化

取未必量戊二醛交联壳聚糖微球载体，退出过多CAT-4菌株产生的粗酶液，置于30℃恒温水浴摇床上振荡1h。别离弃去下层溶液，用去离子水重复洗涤积淀物，患上到后续试验所用的同定化EC降解酶。

4) 戊二醛体积分数对于载体制备的影响

配制体积分数2％、3％、4％、5％、6％以及7％的戊二醛溶液，用注射器将冷藏的壳聚糖微球飞快滴加至区别体积分数的戊二醛溶液巾，使其组成直径平均的微球，在30℃恒温水浴锅中振荡6h。反映结束后，用去离子水重复洗涤，直至洗涤液在280nm处的吸光度小于0.01，即患上戊二醛交联壳聚糖微球载体，置于4℃冰箱保存。用羟胺法[27]测其悬挂醛基品质分数。

5) 戊二醛交联光阴对于载体制备的影响

用注射器将冷藏的壳聚糖微球飞快滴加至体积分数为6％的戊二醛溶液中，使其组成形态规整、平均的微球，在30oC恒温水浴锅中振荡二、四、六、八、10h。其余操作同1.3.1中4)。

1.3.2 酶精力的测定

分说将1mL粗酶液或者1g牢靠化EC降解酶以及超纯水加到2支装有1mL品质分数3％EC溶液的10mL比色管巾，将比色管置于37℃水浴锅中反映15min后退出1mL妨碍剂，短缺混匀后挨次退出各1mL的显色剂I以及显色剂Ⅱ,强烈振荡后不断置于37。C水浴条件下保温20min，用超纯水定容至刻度线，测定并记实A_625nm值。酶活合计公式如下：

式中：M为酶精力；△A_625nm为反映结束后空缺比力与样品测定的光密度值之差：n为待测样液的稀释倍数：k为NH₄⁺规范曲线中斜率的倒数。

1.3.3 EC去除了率的测定

1) 相图的制作

参考文献运用浊度滴定法测定双水相系统的二元曲线。详尽做法如下：将乙醇逐滴退出盛有已经知浓度K₂HPO。溶液的玻璃容器中，直到在25℃时组成领土清晰的两相系统。记实此时乙醇以及K₂HPO₄组成。在此根基上，将去离子水点加到玻璃容器中，患上到一个清晰的单相系统，不断滴加乙醇，再组成两相系统，如斯重复。接着用区别品质浓度的K₂HPO₄重复上述步骤，记实数据。

2) 乙醇以及K₂HPO₄双水相系统(ATPS)

提取“美乐”葡萄酒中EC图1呈现了用乙醇以及K₂HPO₄双水相系统提取EC的道理。以含50μg/LEC以及100μg/L正丙基甲酸酯(PC)的体积分数55％乙醇溶液作为模子溶液，用酒石酸以及NaOH调节pH并记实日后的pH。

量取5mL模子溶液以及过多的K₂HPO₄固体加人离心管中，混匀后以4000r/min离心5min，以确保两相残缺别离。将离心管置于25℃恒温水浴中不断3.5h达到相失调。记实顶相体积并取1.5mL的顶部溶液与150mg无水硫酸镁残缺搅浑，在转速为12000r/min的条件下离心1min。最后，将1mL上清液经由0.45μm膜过滤，用于GC-MS合成。

3) EC的GC-MS检测

运用Agilent7890BGC-5977AMS系统妨碍EC的定量以及定性合成。气相色谱柱为Carbowax20M(30m×0.25μm×0.25妹妹)，以氦气为载气，流量为1.0mL/min，进样口温度200℃，检测器温度250℃。柱温接管挨次升温：初始温度50℃保存1min，以3℃/min升至180℃保存1min，而后以20℃/min升至220℃，保存10min。

质谱条件：以氦气为载气.接管电子轰击源(EI)的电离模式，电子能量70eV；四级杆温度150℃；离子源温度230℃；选取离子监测(SIM)模式，抉择质荷比(m/z)分说为6二、74以及89作EC的监测离子，m/z为62作定量离子：抉择m/z分说为5九、62以及89来监测PC，m/z为62作定量离子。

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