氨基甲酸乙酯降解酶的牢靠化钻研（二）

1.3. 4挥发性风韵物资的氨基检测

1) 香气化合物提取

依据顶空固相微萃取法(HS-SPME)改善的方式[31]提取挥发性风韵化合物，并用GC/MS妨碍合成。甲酸降解将10mL“美乐”葡萄酒样品以及3.6gNaCl放入15mL萃取瓶中，乙酯研再退出20uL20mg/L的牢靠3-辛醇规范溶液。萃取瓶用内衬密封，化钻样品在45℃下失调20min，氨基微萃取在45℃、甲酸降解500r/min的乙酯研搅拌下不断60min。萃取结束将萃取头插入进样口解吸5min。牢靠

2) 色谱条件

用Agilent7890B气相色谱仪与5977A质谱仪妨碍GC-MS合成。化钻色谱柱型号HP-Innowaxcolumn柱(60m×2.5妹妹×0.25μm)，氨基载气是甲酸降解流量为1mL/min的氦气，进样口温度230℃。乙酯研柱温接管挨次升温：初始温度50℃保存5min，牢靠以3％/min升至125℃保存3min，化钻而后以2℃/min升至180℃保存3min，最后以15℃/min升至230℃保存15min。

质谱仪在电子轰击源(EI)的电离模式下运行，运用问隔为0.2S的全扫捕模式(扫捕畛域m/z40～450)，离子源温度200℃。

定性以及定量合成：经由将各组分峰中的化合物与NISTl4.L谱库的规范化合物妨碍立室，并将患上到的质谱以及保存指数(RI)与NISTl4.L谱库巾的规范化合物妨碍比照。用内标法合计各组分的相对于含量，服从呈现为3个重复的“美乐”葡萄酒样品的平均值±规范差。

2 服从合成

2.1 壳聚糖载体交联条件的优化服从

2.1.1 交联剂体积分数对于载体制备的影响

壳聚糖微球载体悬挂醛基的数目与其牢靠化酶能耐的强弱无关。区别体积分数的戊二醛对于壳聚糖微球载体上悬挂醛基品质分数的影响见图2。

由图可知，在未必畛域内，随着戊二醛溶液体积分数的削减，载体上的悬挂醛基品质分数呈回升趋势，可是当戊二醛溶液体积分数达到5％时，载体上悬挂醛基品质分数达2.4％，之后随戊二醛体积分数削减，载体上悬挂醛基反而趋于晃动。运用区别加酶量，测患上数据与此不同。服从诠释，体积分数5％的戊二醛溶液曾经可能提供充实少数目的醛基与壳聚糖载体上的氨基发生交联反映，此时载体对于酶的牢靠量达到最大。因此载体制备时选用体积分数为5％的戊二醛溶液作交联剂即可。

2.1.2 交联光阴对于载体制备的影响

如图3所示，在2～8h畛域内，载体上的悬挂醛基随交联光阴的削减而削减；当交联时问达到8h后，悬挂醛基的品质分数根基连结巩固。诠释8h的交联光阴足以使戊二醛溶液中的醛基与载体上的氨基短缺反映，使载体对于酶的牢靠量最大。因此，抉择8h作为壳聚糖微球载体以及戊二醛溶液的交联光阴。

2.2 牢靠化EC降解酶的酶学性子

2.2.1 牢靠化EC降解酶的最佳反映温度及其晃动性如

如图4所示，经由游离酶以及同定化酶在30、3六、4二、4八、5四、60、66℃以及72℃条件下的酶活服从可知，它们的最适温度分说为30℃以及42℃。同定化酶在30～42℃酶活性逐步增高，最适温度比游离酶略高；在42℃日后降解EC能耐逐步着落，与酶活呈着落趋势的游离酶变换根基不同；但牢靠化酶的酶活在42～72℃均高于游离酶。

泛起最适温度转移可能是南于EC降解酶的空问结构受到同定化载体的影响而略有改动，特意是在42℃日后，牢靠化EC降解酶的空间结构较为晃动，催化底物能耐比游离酶略高。也有其余钻研服从表明牢靠化脲酶与游离酶的最适催化温度有所差距，但两者的催化成果并不存在清晰差距。

晃动性服从呈现，同定化EC降解酶在42℃条件下寄存24h后相对于酶活仍能达到60％以上，诠释牢靠化EC降解酶可能耐受未必畛域的温度，对于情景的适应性较好，在室温情景下无需高温呵护，是一种情景友好型牢靠化酶。

2.2.2 牢靠化EC降解酶的最适pH及其晃动性

从图5可能看出，在pH为3.0、3.三、3.六、3.九、4.二、4.5以及4.8的条件下，游离酶以及牢靠化酶催化底物EC的最适pH有所偏离，游离EC降解酶对于pH4.5的EC溶液具备最大的催化活性，且在pH3.0～4.5酶活性逐步削减，相对于酶活在30％～100％之问；同定化EC降解酶的最适pH为3.6～3.9，且在此畛域内酶活性均高于游离酶，特意在pH3.6左右呈现出最大催化活性。

晃动性服从呈现，牢靠化酶在最适pH条件下反映光阴越长，相对于酶活性的着落速率越快，特意是12～24h期问的相对于酶活变换率远远高于0～12h的变换率。同定化酶在pH3.6条件下部署24h之后的酶活损失率不超过40％，诠释牢靠化EC降解酶的耐酸性较游离酶好，更适于重大情景的操作。以前就有钻研将以京尼平为交联剂与源头于普罗维登斯菌(ProvidenciarettgeriJN-B815)的酸性脲酶妨碍交联，发现此交联酶可能适应黄酒的重大微情景并去除了尿素以及EC。
 

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相干链接：戊二醛，壳聚糖，3-辛醇