致泻大肠埃希氏菌规范魔难方式（一）

大肠埃希氏菌作为个别菌群而存在于人以及动物肠道中，致泻并宽泛存在于人造界。大肠大肠埃希氏菌的埃希某些菌株对于人有致病性。人以及动物的氏菌带菌是转达本菌引起食物中毒的紧张原因。

致泻大肠埃希菌(Eschrichia coli)，规范简称致病性大肠菌。魔难依据其致病机制可分为4个规范。致泻肠道致病性大肠菌(Enteropathogenic E．coli，大肠EPEC)，埃希肠道侵袭性大肠菌(Enteroinvasive E．Coli,氏菌EIEC)，产肠毒素大肠菌(EntervtoxigencE．coli，规范ETEC)，魔难肠道出血性大肠菌(Entero一hemorrhagic E．coli，致泻EHEC)。大肠EPEC主要引起新生儿的埃希腹泻。EPEC、ETEC引起腹泻腹痛型胃肠炎。EIEC引起的胃肠炎酷似痢疾。EHEC引起出血性大肠炎。

一、魔难方式

检样主要为可疑食物、吐逆物、粪便。粪便标本尽可能在患者负责抗菌素治疗前网络。样品网络后，应尽快魔难，除了易腐食物在魔难以前应冷藏外，平凡不冷藏。

(一)别离作育及生化判断

无菌称取检样25g，加在225mL营养肉汤中，均质lmin。掏出过多，接种乳糖胆盐作育基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶内，于36±1℃作育6h。挑取1环，接种于一管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃作育18h。

将乳糖发酵阴性的乳糖胆盐发酵管以及增菌液分说划线接种麦康凯或者伊红美蓝琼脂平板；传染严正的检样，可将检样匀液间接划线接种麦康凯或者伊红美蓝平板，于36±1℃作育18～24h，审核菌落。不光要留意乳糖发酵的菌落，同时也要留意乳糖不发酵以及缓慢发酵的菌落。

自分说平板上间接挑取数个菌落，分说接种三糖铁琼脂(TSI)或者克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些作育物分说接种卵白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤以及赖氨酸脱羧酶试验作育基。以上作育物均在36℃作育住宿。

FSI斜面产酸或者不产酸，底层产酸，H₂S阴性，KCN阴性以及尿素阴性的作育物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或者H₂S、KCN、尿素有任一项为阴性的作育物，均非大肠埃希氏菌。须要时做氧化酶试验以及革蓝氏染色。

(二)血清学试验

假如试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂作育物，用肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌以及产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清以及肠道出血性大肠埃希氏菌0157血清作玻片凝集。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包罗的单价0血清作试验。致泻大肠埃希氏菌所包罗的0抗原群见表5—1。如与某一个单价O血清泛起强凝集反映，即为假如试验阴性。

证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland 3号比浊管至关的浓度。原效价为1:160-1:320的O血清，用0.5％盐水稀释至1:40。稀释血清与抗原悬液在10妹妹×75妹妹试管中等量搅浑，做单管凝集试验。混匀后放于50⁰C水浴箱内，经16.h后审核服从。如泛起凝集，可证实为该0抗原。

(三)肠毒素试验

产毒作育：将试验菌株以及阴性及阴性比力菌株分说接种于0.6 mLCAYE作育基内，37⁰C振荡作育住宿。退出20000IU／mL的多粘菌素B0.05mL，于37⁰C1h，以4000r/min离心15min，别离上清液，退出0.1％硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。

酶联免疫吸附试验检测不耐热的肠毒素(LT)(双抗体夹心法)：

(1)包被：先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT以及ST酶标诊断试剂盒中掏出包被用LT抗体管，退出包被液0.5mL，混匀后全副吸出于3.6mL包被液中混匀，以每一孔100μL量退出到40孔聚苯乙烯硬反映板中，第一孔留空作比力，于4⁰C冰箱湿盒中住宿。(2)洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反映板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。(3)敞开：每一孔加100μL敞开液，于37⁰C水浴中1h。(4)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加样本：每一孔分说加种种试验菌株产毒作育液100μL，37⁰C水浴中1h。(6)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶标抗体：先在酶标I。T抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全副吸出于3.6mL稀释液中混匀，每一孔加100μL，37⁰C水浴中1h。(8)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反映：每一孔(包罗第一孔)各加基质液100μL，室温下避光浸染5～10min，退出妨碍液50μL。(10)结武判断：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性比力3倍以上者为阴性。目测色调为桔黄色或者清晰高于阴性比力为阴性。

酶联免疫吸附试验检测耐热肠毒素(ST)(抗原相助法)：(1)包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每一孔50μL退出于40孔聚苯乙烯软反映板中。加液后僻静敲板，使液体弥漫孔底。第一孔留空作比力。置4℃冰箱湿盒中住宿。(2)洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上，(3)敞开：每一孔加敞开液100μL，37℃水浴lh。(4)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加样本及ST单克隆抗体：每一孔分说加各试验菌株产毒作育液50μL，稀释的ST单克隆抗体50μL(先在ST单克隆抗体管中加O.5 mL稀释液，混匀后全副吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用)，37℃水浴lh。(6)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶符号免抗鼠Ig复合物：先在酶符号免抗鼠Ig复合物管中加O.5mL稀释液，混匀后全副吸出于3.6mL稀释液中混匀，每一孔加lOOμL，37℃水浴1h。(8)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反映：每一孔(包罗第一孔)各加基质液100μL，室温下避光5～10 min，再退出妨碍液50μL。(10)结武判断：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值：

目测无色或者清晰淡于阴性比力为阴性。

双向琼脂散漫试验检测LT：将被检菌株按五点环形接种于Elek氏作育基上。以同样操作共做两份，于36℃作育48h。在每一株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6h，使肠毒素渗透琼脂中，在五点环形菌苔各5妹妹处的中间，挖一个直径4妹妹的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中间孔内滴加LT抗毒素30μL，用已经知产LT以及不产毒菌株作比力，于36^°C经15～20h审核服从。在菌斑以及抗毒素孔之间泛起红色积淀带者为阴性，无积淀带者为阴性。

参考资料：食物卫生微生物魔难规范手册

相干链接：大肠埃希氏菌，微生物，伊红美蓝琼脂平板