金樱子棕色素的提取及其抗氧化活性钻研（一）

金樱子（RoselaevigataMichx），金樱及又名刺榆子、棕色金罂子、抗氧山石榴、化活金壶瓶、性钻灯笼果等，金樱及为蔷薇科常绿攀缘动物，棕色主产于广东、抗氧广西、化活湖南、性钻江西、金樱及浙江、棕色江苏、抗氧安徽等地，化活均为家养。性钻成熟的金樱子含有多糖、黄酮类、三萜类及其衍生物等种种化学成份。其用途宽泛，可用来酿酒、熬糖、加工饮料等。其提取物金樱子棕色素开始判断为黄酮类化合物，这种物资具备优异的抗氧化活性功能，可经由翦灭从容基达到抗氧化成果。本文以金樱子为质料，探究出一条提取金樱子棕色素的新的工艺道路，该道路重大易行，防御了运用毒性有机溶剂，可用于工业化斲丧。同时本文接管FRAP法以及DPPH法，以维生素C以及BHT为比力物，开始品评辩说了金樱子棕色素的抗氧活性的能耐。接管荧光以及化学发光法测定色素翦灭羟从容基以及超氧阴离子从容基的能耐，以及其抑制亚油酸脂质过氧化的浸染，为普及金樱子棕色素的运用价格提供依据。

一、试验全副

一、试验资料

（1）试验质料与试剂

金樱子干果（购自当地药店）；FeCl₃、Fe-SO₄、HCI、维生素C、H₂O₂、苯甲酸、醋酸、醋酸钠、无水乙醇、95％乙醇、罗丹明B、三羟甲基氨基甲烷、二丁基羟基甲苯（BHT），以上试剂均为国产合成纯试剂；鲁米诺（1uminol，Merck公司）；邻苯三酚（Merck公司）；三吡啶三吖嗪（tripyridyhriazine，TPTZ，Sigma公司）；二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，Sigma公司）。试验用水均为二重蒸馏水。

（2）试验仪器

UV-1700紫外-可见分光光度计、薄弱化学发光仪（尤尼柯（上海）器有限公司）；CaryEclipse荧光分光光度计（美国瓦里安公司）；BS200s电子合终日平（上海天平仪器厂）；超滤膜（自制）；AB-8大孔吸附树脂（南开大学化工场）；旋转蒸发仪RE52A（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6050型真空去世板箱（上海博迅实业有限公司）。

二、试验方式
（1）金樱子棕色素的提取工艺

金樱子→去杂→去世板→破碎捣毁→煤油醚脱脂→乙醇水溶液浸提→过滤→滤渣→二次浸提→滤渣
 

（2）FRAP法测定金樱子棕色素总抗氧化能耐

FRAP法是基于氧化复原反映的比色法。在较低的pH条件下Fe³⁺三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被试样中复原物资复原为Fe²⁺方式，泛起出蓝色，在波长593nm处具备最大光罗致，依据吸光度巨细合计样品抗氧化活性的强弱。

分说配制0.1g／L的金樱子棕色素、BHT及维生素C溶液作为样品，FRAP使命液为10.0妹妹ol／LTPTZ溶液、20.0妹妹ol／LFeCl3溶液以及0.3妹妹ol／L醋酸钠缓冲液以1∶1∶10组成的搅浑物。用微量移液器分说精确排汇色素溶液、BHT溶液、维生素C溶液0.1mL，分说退出预热至37℃的1.80mLTPTZ使命液混匀，终反映液用各自溶剂补足至5.00mL，37℃反映10min，分说以各自溶剂为空缺比力，测定593nm处的吸光度值（A），以1.00妹妹ol／LFeSO₃为规范，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO₄的毫摩尔数呈现。

FeSO₄规范曲线的制备：详尽移取0.十、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00妹妹oVLFeS0₄规范溶液各0.10mL分说置于5只微量试剂瓶中，分说退出预热至37℃的1.80mLFRAP使命液并用蒸馏水补足至5.0mL，混匀，37℃反映10min，以试剂做空缺，在波长593nm处测定吸光度值，以吸光度值（A）为纵坐标，浓度为横坐标，合计回归方程。

（3）DPPH法测定金樱子棕色素抗氧化活性

DPPH是一种晃动的有机从容基，其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大罗致峰为517nm。当DPPH溶液中退出从容基翦灭剂时，溶液色调变浅，A_517nm。值变小，而且吸光度变小的水平与从容基被翦灭的水平呈线性关连。因此可用从容基的翦灭状态来评估某物资的抗氧化能耐，其抗氧化能耐用翦灭率来呈现，翦灭率越大，抗氧化能耐越强。

先用无水乙醇配制2×10^-4mol／L的DPPH·溶液，同时候说称取未必量金樱子棕色素、BHT以及维生素C用蒸馏水消融，并将其稀释为如下浓度：0.0一、0.0二、0.0三、0.0四、0.059／L，作为测试液。用微量移液器精确排汇测定液2.0mL与DPPH溶液2.0mL搅浑，摇匀后部署30min，以无水乙醇为比力，测定波长517nm处的吸光度值AO同时测定2.0mLDPPH·溶液与2.0mL无水乙醇搅浑液的吸光度Ao，以及2.0mL测定液与2.0mL无水乙醇搅浑液的吸光度A₁，依据如下公式合计测定液对于DPPH·的翦灭率。按以上测试方式分说测定其翦灭率，患上出直线回归方程，进而合计其50％翦灭率（IC₅₀）。

翦灭率=[1一（A—A1）／Ao×100％

式中：A为加测试液后DPPH的吸光度；A₁为测定液在测定波长吸光度；Ao为未加测定液时DPPH的吸光度。

（4）金樱子棕色素翦灭超氧阴离子的能耐

接管鲁米诺—邻苯三酚系统。邻苯三酚在碱性条件下能迅速的发生自氧化，产生一系列的有色产物。邻苯三酚与鲁米诺系统为快捷发光，能在邻苯三酚自氧化速率呈线性的光阴内达到发光峰值。色素中的抗氧化物资可能抑制超氧阴离子，着落其浓度，从而削弱发光强度。发光强度的着落值与色素中抗氧化物资翦灭O₂^-从容基的能耐成正相干，因此，可能间接地测定色素对于O₂^-从容基翦灭的能耐。

在测定管中退出1.0妹妹oL／L鲁米诺（用0.1mol／L的碳酸钠溶液配成）2.OmL，退出区别量的色素（水乳浊液）溶液（或者用同体积的双蒸水做空缺），再注入20μL蒸馏水，最后退出10.0妹妹ol／L邻苯三酚20μL起动反映，快捷混匀，赶快置入样品室中，在319.5nm波短处每一距离lmin测吸光值一次，共反映5min。每一个样品平行做三次，取平均值，按下式合计翦灭率。

翦灭率=（CL₀-CL）／CL_o×100％

式中：CL₀为空缺试验吸光度；CL为测试液吸光度。

（5）金樱子棕色素翦灭羟从容基的能耐

接管罗丹明B-Fenton系统。Fenton反映因此过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化系统的氧化反映方式，在反映中可产生羟从容基（·OH）。罗丹明B是一种荧光染料，自身能产生特色荧光，其激发波长以及发射波长分说为358nm以及575nm。Fenton反映系统产生的·OH可能迅速氧化罗丹明B，使罗丹明B的荧光强度清晰着落，从而间接测定羟从容基的产生量。

羟从容基检测：在测试管中挨次退出Tris—HCL缓冲溶液（pH5.5）6.0mL，1.92×10^-3妹妹ol／L罗丹明B溶液19.2uL，4.08妹妹ol／LH₂0₂溶液0.48mL，0.64妹妹ol／LFeS0₄溶液1.28mL，摇匀，反映5min后，用蒸馏水补足终体积至10.0mL。15min后在358nm激发波长下测定575nm处的荧光强度F，合计其与空缺参比（罗丹明B与缓冲溶液）荧光强度F₀之差△F。

在上述系统中，退出区别浓度的色素水乳浊液，测定荧光强度Fs；未加Fenton试剂与色素的系统为空缺系统，测定荧光强度F₀；则翦灭率按如下公式合计。

翦灭率=（F₀一Fs）／F0×100％

（6）金樱子棕色素抑制亚油酸脂质过氧化浸染

Fe²⁺／亚油酸系统中，过渡金属离子如Fe²⁺等，可能经由多种蹊径增长脂质过氧化反映的妨碍。亚油酸是多不饱以及脂肪酸，披露在有氧情景中会发生被动氧化，试验时普及情景温度可能减速其氧化历程，经由测定其削减样品后的过氧化水平，并与空缺比力比照，可能评估样品的抗脂质过氧化活性。

2mL样品溶液退出亚油酸乳浊液2.5mL，2.5mL磷酸盐缓冲液（0.2mol／L，pH7.0），0.1mL501xmol／L的氯化亚铁溶液，0.1mL50μmoL／L的维生素C溶液，37℃保温24h，每一8h取0.1mL退出5mL75％乙醇，0.1mL30％的硫氰酸铵，0.1mL20妹妹ol／L的氯化亚铁的3.5％HCL溶液（别致配制），室温下部署3min，磷酸盐缓冲液调零，以不加样品为空缺，500nim下测定吸光度。抑制率合计公式：

抑制率（％）=（A_空缺一A_样品）／A_空缺×100

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