保加利亚乳杆菌的筛选及其发酵乳中的风韵物资（一）

乳酸菌是保加指发酵乳糖主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阴性细菌的利亚总称。其宽泛扩散于人造界中，乳杆乳中平凡主要存在于人体、菌的及动物体及种种发酵食物中。筛选1905年，发酵Grigoroff初次从酸奶中别离出保加利亚乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）。韵物该菌株是保加酸奶发酵剂中紧张的菌种之一，具备清肠、利亚整肠、乳杆乳中普及机体免疫力、菌的及抗癌及抗肿瘤等紧张的筛选生物学功能。

Kataoka等研收回一种样品前解决技术-固相微萃取（Solid-phasemicroextraction，发酵SPME）。韵物SPME技术具备操作重大、保加老本低、灵便度低等短处，宽泛运用在风韵检测的各个畛域。武士美等接管SPME-GC/MS技术对于保加利亚乳杆菌发酵乳中的挥发性风韵物资妨碍合成，判断了乙酸、乙醛、双乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯等多种风韵化合物，并筛选出具备优异风韵的菌株。Bao等接管该技偶合成干酪乳杆菌（Lactobacillscasei）发酵乳中的挥发性化合物，检测出的主要风韵化合物有乙酸、丁酸、双乙酰以及己酸乙酯等。任为一等接管该技偶合成发酵乳中的风韵物资，发现双乙酰、乙偶姻、乙醛、2-壬酮等化合物对于发酵乳风韵贡献较大。

酸奶是一种受斲丧者兴致的传统发酵乳废品，可是，对于保加利亚乳杆菌在牛乳发酵历程中产生的风韵及其发酵特色的报道较少。本钻研以来自蒙古国以及西藏传统发酵乳废品中的7株保加利亚乳杆菌为钻研工具，系统审核蕴藏12h时发酵乳中风韵物资的多样性，并测定发酵以及蕴藏12h时的pH值、滴定酸度（ＴA）、活菌数以及黏度，旨在为传统酸奶发酵剂的根基钻研提供参考。

1资料与方式

1.1菌株与试剂

内标（InternalStandard，ISＴD）1，2-二氯苯，Sigma公司；全脂奶粉，美国Fonterra公司；MRS液体作育基（MRSBROＴH），英国Oxoid公司。试验菌株：7株保加利亚乳杆菌由试验室提供。菌株详尽信息见表1。

1.2试验方式

1.2.1样品制备

将真空冷冻去世板收藏的保加利亚乳杆菌接种于MRS液体作育基中，陆续传3代，使菌株精力达最大。在50mL以及200mLMRS液体作育基中扩充作育，离心收集菌体，将菌体重悬于无菌PBS呵护剂中制备菌悬液。取过多蒸馏水加热至50℃，退出11.5%全脂乳粉搅拌消融，当水温升至60℃时退出6.5%蔗糖，水合30min，且温度始终连结在60℃，陆续均质2次（65℃，15MPa以及35MPa），患上到的均质乳在95℃解决5min后快捷冷却至42℃。将制备好的菌悬液以5×10⁷CFU/mL的量接种到均质化的全脂乳中，分装至样品瓶，并在42℃发酵。待样品的pH值达到发酵尽头4.5，ＴA在70～90°Ｔ时，将样品移至4℃蕴藏12h，待测。

1.2.2发酵乳的理化特色

1.2.2.1pH值以及滴定酸度的测定

发酵乳样品用雷磁PHS-3C型pH计丈量，调整温度在20～22℃畛域，平行丈量发酵乳的pH值。运用电子天平精确称量5g发酵乳样品，置于100mL锥形瓶中，向锥形瓶中退出40mL蒸馏水以及3滴酚酞调唆剂，短缺摇动。退出0.1mol/LNaOH规范溶液滴定至泛起微红色且30s内不褪色。记实退出的NaOH规范溶液体积。每一个发酵乳样品测定3个平行。合计滴定酸度（ＴA）的公式（1）如下：

式中：X—发酵乳样品的酸度，°Ｔ；c—NaOH规范溶液浓度，mol/L；v—滴定时斲丧的NaOH规范溶液体积，mL；m—发酵乳样品的品质，g；0.1—酸度事实界说NaOH溶液的浓度，mol/L。

1.2.2.2黏度的测定

取40g发酵乳样品，用黏度仪的4#转子测定其黏度，转子转速100r/min，扭矩20%～100%，测守光阴30s，每一个样品测定3个平行，取平均值。

1.2.2.3乳酸菌活菌

计数接管稀释平皿泼洒法检测保加利亚乳杆菌发酵乳中活菌数的变换。用0.85%无菌NaCl对于样品妨碍10倍梯度稀释，分说取10^-5，10^-6，10^-7的稀释液各1mL于无菌作育皿上，37℃厌氧作育48h。

1.2.3挥发性风韵物资的测定

运用Agilent7890B气相色谱仪以及5977A质谱仪测定发酵乳中的挥发性风韵化合物。将萃取头（50/30μm二乙基苯/碳份子筛/聚二甲基硅氧烷）在Agilent7890B气相色谱仪进样口（250℃）老化5min，插入气相瓶上方，萃取样品中的风韵化合物。萃取条件：温度50℃，磁力搅拌器转速300r/min，萃取光阴60min。柱温：接管挨次升温，初始温度35℃，连结5min；以5℃/min升至140℃，连结2min后以10℃/min速率升至250℃。试验用载气为高纯氦气，载气流速1.0mL/min，不分流进样。汽化室温度250℃。电离方式EI离子源，电子能量70eＶ，离子源温度230℃，品质扫描畛域m/z35～500，发射电流100μA，检测电压1.4kＶ，无溶剂延迟。

1.2.4定性与定量合成

运用随机照料Masshunter使命站NISＴ11规范库被动检索各组分质谱服从，依据保存光阴合计挥发性风韵化合物的保存指数（retentionindex，RI）。参考相干文献报道的RI值判断发酵乳样品中的挥发性风韵物资。保存指数（RI）值代入公式（2）合计：

式中：RＴ——保存光阴（min）；RＴ_（Z）、RＴ_（Z+1）以及RＴ_（X）分说为正构烷烃碳原子数为Z、Z+1以及待测物X的保存光阴，且正构烷烃碳原子数的保存光阴凭证RＴ_（Z）（X）（Z+1）的挨次原则。

将1，2-二氯苯溶液作为ISＴD退出发酵样品中，接管峰面积归一化法合计所有组分的相对于峰面积比。样品中各组分风韵物资的浓度代入公式（3）合计：

式中c_i—试验样品中各挥发性风韵化合物的品质浓度，μg/L；cs—1，2-二氯苯的品质浓度，μg/L；A_i—样品中待测物资对于应的色谱峰面积；As—ISＴD的色谱峰面积。
 

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