细胞壁缺失对于副溶血性弧菌生物学特色的影响（一）

副溶血性弧菌是细胞性弧响一种嗜盐性弧菌，属于革兰氏阴性短杆菌，壁缺该菌大多存在于远海岸的失对贝类以及淡水鱼类等水产物中，无心也会出如今腌渍食物中，于副是溶血天下上沿海区域引起食物中毒主要的食源性致病菌之一。据预计，菌生每一年约有7600万人患病，物学5000人去世于食源性疾病。特色其中很大一全副归因于梵衲氏菌以及副溶血性弧菌。细胞性弧响副溶血性弧菌最先是壁缺在1950年日本的一次由沙丁鱼引起的大规模食物中毒事件中发现的，之后逐步在列国的失对沿海区域发现，并不断至今，于副已经超过梵衲氏菌成为天下食源性致病菌之首。溶血其熏染蹊径主若是菌生食用未残缺煮熟的海鲜类食物，进而导致急性胃肠炎，物学甚至会使人诞生。同时，副溶血性弧菌也是水活泼物弧菌病爆发的病原体，给水产养殖业带来重大的经济损失。深入钻研副溶血性弧菌的防控技术，对于增长水产物的食用牢靠以及陆地经济发展具备双重意思。

因为在临床治疗以及水产养殖系统中宽泛运用抗菌剂，副溶血性弧菌中耐药株的盛行日益加剧，50％的临床以及情景别离株具备耐多药性。自1968年喹诺酮类药物问世以来，临床上不断未引入实用坚持革兰氏阴性菌的新型抗生素同。细菌对于现有抗生素已经进化出多种坚持机制，如经由被动外排系统增强药物的外排浸染，产生口一内酰胺酶使药物患上到活性，或者将药物浸染的靶点加以修饰或者改动等等，急需追寻具备新的浸染位点且牢靠实用的替换防治策略。

革兰氏阴性菌之以是很难找到实用的抑制药物，主若是因为其细胞的包膜结构较重大。具备双层膜结构(位于内侧的细胞质膜称为内膜，细胞壁最外层的膜称为外膜)。在两层膜间为肽聚糖层。与外膜配合组成细胞壁。外膜是革兰氏阴性菌的特有结构，具备典型的不同过错称性磷脂双层结构，由脂多糖、磷脂以及外膜卵白组成。不断以来，细胞与外界情景的物资替换部位主要关注的是细胞质膜，近10年间钻研职员才开始关注外膜，特意是外膜卵白在物资穿膜历程中的浸染。外膜卵白包罗衔接外膜层与肽聚糖层的脂卵白以及跨外膜的孔卵白。单体孔卵白由8～22个偶数跨膜链以反向平行方式经由相邻链间的氢键浸染组成β-桶状结构。跨膜链的数目决定孔卵白的拓扑结构，从而导致孔径的区别。孔卵白可能抉择性地罗致种种营养物资，同时也能拦阻多种有害大份子物资进入细胞。在去掉细胞壁的大肠杆菌原生质体中，胞内高积攒化合物与胞内低积攒化合物之间的积攒差距清晰变小，这一服从证实外膜是小份子在革兰氏阴性菌中化合物积攒的主要拦阻啊。吴贤斌等曾经将大肠杆菌外膜孔卵白OmpW去除了，发现缺失株对于硫酸新霉素以及氨苄青霉素的锐敏性清晰削减。与亲本株比照，在大肠杆菌孔卵白OmpF/OmpC缺失株中审核到高积攒药物积攒量清晰着落。诠释小份子穿过外膜主要经由孔卵白同。以上钻研服从均呈现，细胞壁特意是外膜对于革兰氏阴性菌的生涯是必不可少的，而去除了细胞壁或者是外膜对于革兰氏阴性菌可能是致命的。

肉桂醇是我国《食物削减剂运用卫生规范》中应承运用的食物香料。被证实对于革兰氏阴性菌以及阴性菌均有抑菌成果

Mazzarrino等针对于肠炎梵衲氏菌以及单增李斯特菌筛选出21种有抑菌活性的精油，发现肉桂的抑菌成果是实用的。当初对于肉桂醇对于副溶血性弧菌的抑制作用及机理的钻研尚未见报道，本文接管肉桂醇作为抑菌剂探究细胞壁的缺失对于副溶血性弧菌生物学特色的影响。清晰肉桂醇的浸染靶点，为副溶血性弧菌的防控提供试验依据。

1 资料与方式

1.1 菌株、作育基以及试剂

副溶血性弧菌保存于-80℃超高温冰箱中。

3％氯化钠碱性卵白胨水(APW)、营养琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司。以上作育基均121℃灭菌20min。
肉桂醇、Tris、EDTA、硫酸粘杆菌素、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、SYBRGreenI、PI，生工生物工程(上海)股份有限公司；溶菌酶、马来酸盐，合肥博美生物科技有限责任公司：考马斯亮蓝G-250。天津市福晨化学试剂厂；蔗糖、氯化镁、磷酸二氢钾、乙醇，天津市天力化学试剂有限公司；磷酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、氯化钠、碳酸氢钠，天津市风船化学试剂科技有限公司：罕用药敏试纸，杭州滨以及微生物试剂有限公司；牛血清卵白，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器、配置装备部署

ZD-85A气浴恒温振荡器，金坛市科析仪器有限公司；真空去世板箱，上海一恒迷信仪器有限公司；G154DS型被动蒸汽压力灭菌锅，厦门致徽仪器有限公司；5804R高速冷冻离神思，Eppendorf中国有限公司；Czone5F被动菌落计数仪，杭州迅数科技有限公司；perkinelmerv3酶标仪，成都必成丰瑞生物技术有限公司：UV-2550紫外-可见分光光度计。日本岛津公司：Scientz-IID超声波细胞破碎捣毁机。宁波新芝生物科技股份有限公司；SDS电泳系统、GelDocXR+凝胶成像仪，美国BIO-RAD有限公司；AccuriC6Plus流式细胞仪，BD生物迷信北京卓越中间。

1.3 试验方式

1.3.1 菌体活化及原生质体制备

将副溶血性弧菌按1％的接种量退出APW中。37℃、130r/min作育12h，陆续作育2代。

参考Xu等的方式制备副溶血性弧菌原生质体。将活化的菌液置于4℃、6000r/min离心收集菌体细胞。用0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)洗涤3次。细胞重悬于含有0.5mol/L蔗糖的0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)中，飞快退出EDTA溶液(pH8.0。20min之内实现此步)至其终浓度为0.01mol，L。37℃、100r/min振荡20min，取患上一组作废外膜层的细菌细胞，留此阶段全副菌体冷藏备用。另一全副菌体在4℃、3000r/min离心收集细胞，用SMM缓冲剂(20妹妹ol/L马来酸盐、0.5mol/L蔗糖、20妹妹ol/LMgCl2，pH6.5)洗涤2次，细胞重悬于SMM缓冲剂(含1mg，mL溶菌酶)中，37℃、100r/min振荡30min，作废肽聚糖层，飞快滴加EDTA溶液(pH8.0)使其终浓度为0.01mol/L，放入37℃的作育箱温育15min。取患上一组去壁的细菌细胞，将此原生质体冷藏备用。未解决的菌体同样冷藏备用。

1.3.2 最小抑菌浓度测定

接管二倍稀释法解决肉桂醇原液(品质浓度为1g/mL)，使其品质浓度挨次为原液的1/2至1/2048。试管内物资组成为8.9mLAPW、1mL菌液(分说为UG、OMDG以及CWDG)以及0.1mL区别品质浓度的肉桂醇溶液。所有试管置于37℃作育24h后审核菌体愿望状态，使作育液连结廓清的最小药物资量浓度即为肉桂醇对于副溶血性弧菌的最小抑菌浓度(MIC)。

1.3.3 细胞膜残缺性测定

参考张赞彬等的方式，将菌悬液在4℃、3000r/min条件下离心15min收集菌体，磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤着重悬。向新的离心管中退出10mL菌悬液以及45仙L肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空缺)，37℃作育6h，在6000r/min下离心3min收集上清液。在波长260nm处测定其吸光度值，即为菌液中核酸的含量。同时接管考马斯亮蓝法对于上清液中的卵白质妨碍染色，测定其在波长280nm处的吸光度值，即为菌液中卵白质的含量。

1.3.4 硫酸粘杆菌素试验

考Richter等的方式并适量更正，先向96孔板每一孔中退出20μL硫酸粘杆菌素溶液(6μmol/L)以及178μL稀释好的菌悬液，静置30min，再退出区别品质浓度的肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空缺)2μL，混匀并置于37℃作育18～24h后用酶标仪测定其在波长280nm处的吸光度值。

1.3.5 外膜卵白的提取及品质浓度测定

参考Chiu等的方式妨碍外膜卵白的提取，并稍作更正。在4000r/min、4℃条件下收集细胞，经4℃心理盐水洗涤3次。重悬于大批体积的盐水中。运用超声波细胞破碎捣毁机妨碍细胞破碎解决(300W、冰浴5min)，间歇10次实现。在5000r/min、4℃条件下离心20min，收集上清：于15000r/min离心40min，积淀重悬于2g/100mLSLS中并在室温条件下孵育1h后，于15000r/min离心40min，积淀即为外膜卵白。

运用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定取患上的外膜卵白品质浓度。首先运用规范卵白溶液绘制规范曲线，如图1所示。测定波长595nm处外膜卵白样品的吸光度值。依据规范曲线公式合计出外膜卵白的品质浓度。

1.3.6 外膜卵白SDS-PAGE

接管非陆续缓冲系统垂直板电泳，选用12％别离胶，5％稀释胶。外膜卵白样品滚水浴5min，加样量为20μL[16μL卵白溶液+4μL(5×)卵白上样缓冲液]，80V电压妨碍样品稀释，样品进入别离胶后加压至120V，当溴酚蓝行将跑出胶板时，停止电泳。胶板考马斯亮蓝染色后置于凝胶成像系统摄影。

1.3.7 外膜卵白相助试验

考Lam等的方式妨碍外膜卵白相助试验，并作未必的改动。将50μL肉桂醇、50μL外膜卵白(品质浓度在2～512μg/mL)退出96孔板中，37℃下孵育1h。之后向每一孔中退出100μL副溶血性弧菌悬液(约2.5×106个/mL。使肉桂醇终品质浓度为1/2MIC)，37℃下孵育2h。各孔中掏出50μL搅浑作育液，转移至第2个96孔板中，并退出100μL盐水以及染料搅浑物(即含有0.1％SYBRGreenI以及0.1％PI的盐水)，用流式细胞仪合成第2个96孔板中的各孔，判断细胞凋亡状态。

1.3.8 药敏试验

参考李莉等的方式，向100mL营养琼脂作育基中分说退出500μL解决好的菌液(包罗UG、OMDG、CWDG)，混匀后倒平板，待作育基凝聚后向每一个平板中放入3片相同的药敏试纸(包罗四环素、红霉素、万古霉素、环丙沙星、利福平)，所有平板置于37℃作育18～24h，丈量抑菌圈直径。

1.3.9 统计合成

数据解决接管Excel2010并绘制图表，运用SPSS19.0对于所有数据妨碍差距清晰性合成，一着实施均重复测定3次，测定服从呈现为平均数±规范差。

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