酶活性抑制合成法（三）

(二)乙酸-β-萘酯-固蓝B盐显色法

此法运用底物水解产生的酶活β-萘酚与固蓝B盐浸染天生偶氮化合物而显色。

(三)乙酸羟基吲哚显色法

底物乙酸羟基吲哚水解产生吲哚酚，性抑吲哚酚被氧化组成有色产物而显色。制合

(四)乙酸靛酯显色法

底物乙酸靛酯水解产生有色的成法产物靛酚蓝而显色。

(五)碘化硫代胆碱褪色法

底物碘化硫代乙酰胆碱水解天生碘化硫代胆碱，酶活碘化硫代胆碱能使蓝色的性抑2，6-二氯靛酚复原褪色。制合

(六)碘化硫代丁酰胆碱显色法

底物碘化硫代丁酰胆碱(BTCI)水解天生碘化硫代胆碱，成法碘化硫代胆碱与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反映天生黄色溶液。酶活

在上述显色反映中，性抑乙酰胆碱-溴百里酚蓝显色法灵便度不高，制合故很少运用。成法而以乙酸-β-萘酯-固蓝B盐、酶活乙酸靛酯、性抑吲哚乙酸酯及其衍生物为底物的制合显色法灵便度高，适应性广，底物以及显色剂较重大取患上，因此被宽泛运用。

在酶活性抑制法中，影响检测灵便度的因素是多方面的，除了底物的种类以及显色反映规范外，酶的源头、酶与底物的配合、抑制剂的种类以及性子区别，对于农药的检测限、特同性以及晃动性区别。有些农药在生物体外是较弱的酶抑制剂，但经由生物氧化可成为较强的酶抑制剂，如乐果+02→氧化乐果、对于硫磷+02→对于氧磷可清晰普及对于乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制活性。依据该道理，可能接管在体外看待测农药妨碍氧化解决等方式，使之成为较强的酶抑制剂，以普及看待测农药的检测灵便度。罕用的解决剂有冷的发烟硝酸、稀溴水、过氧化氢、过氧乙酸、溴代琥珀酰亚胺等，或者接管紫外光映射解决。

六、酶活性抑制法中的样品制备

蔬菜、瓜果等别致农产物中的有机磷以及氨基甲酸酯类农药残留是运用酶活性抑制法妨碍快捷检测的主要工具，其指标主若是先对于大批量样品妨碍现场快捷筛选检测，对于不同格样品再妨碍复检，对于复检仍不同格的大批样品再用色谱法或者色谱质谱联用法妨碍合成，以便削减试验室仪器合成的使命量，普及检测功能。酶活性抑制法中蔬菜瓜果样品的制备与仪器合成样品制备比照，方式比照重大。

(一)磷酸盐缓冲液提取法

磷酸盐缓冲液提取法遵照国家规范《蔬菜中有机磷以及氨基甲酸酯类农药残留的快捷检测》(GB／T 5009.199—2003)妨碍。

一、叶菜类的磷酸盐缓冲液提取法：取去除了土壤的待测样品(白菜、甘蓝、油菜、韭菜等)剪成1cm2的小块(韭菜剪成1cm长的小段)，随机取小块或者小段样品1g，放入,烧杯或者提取瓶中，退出5mL提取缓冲液(15.0g Na2HPO4·12H2O以及1.59g NaH2P04溶于500 mL蒸馏水，pH 7.5)，振荡l～2 min。倒出提取液，静置3～5 min，用于丁酰胆碱酯酶分光光度法测定。或者随机取小块或者小段样品约5g，放入提取瓶中，加10mL缓冲液，振摇50次，静置2 min以上，用速测卡法测定。

二、果菜及瓜果类的磷酸盐缓冲液提取法：取待测样品(番茄、黄瓜、青椒、茄子、苹果、梨等)去除了外表土壤，用取样器沿果菜外表处取约1cm厚的样品放人提取瓶中，退出提取缓冲液振荡l～2min。倒出提取液，静置3～5min后待测。对于萝卜等根菜类样品，先去除了外表土壤以及须根，再按果菜类样品提取方式提取。

(二)有机溶剂提取法

有机溶剂提取法遵照国家规范《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的浅易魔难方式酶抑制法》(GB／T 18630一2002)妨碍。

擦去蔬菜外表的泥水，将可食全副剪碎，取2g置10mL提取瓶中，加5mL丙酮浸泡5min，不断振摇，加0.2g碳酸钙(对于番茄等酸性较强的样品可加0.3～O.4g)。如色调较深，可加0.2g活性炭，摇匀，过滤。取1mL丙酮滤液于5mL烧杯中，吹干丙酮后加0.6mL 1/15m01/L pH 7.7的磷酸盐缓冲液消融，退出0.2mL 0.5％(m／V)次氯酸钙水溶液摇匀，部署10 min妨碍氧化解决，再退出0.6mL 10％(m/V)亚硝酸钠水溶液摇匀，复原过多的氧化剂，解决液待测。

良多蔬菜(如葱、蒜、韭菜、芹菜、番茄、萝卜、茭白、蘑菇等)含有对于酶活性有影响的次生代谢产物，重大使测定服从产生假阴性。叶绿素等色素也可能影响显色反映服从。解决这些样品时，可接管部份(株)蔬菜浸提或者接管外表测定法。在制样中将样品切成1～2cm的小块，在确保农药提取成果的同时操作浸提光阴，以削减色素等干扰物资的溶出。如样品浸提液泛起污浊，应适量削减样品的静置光阴。

七、酶活性抑制合成的检测方式

(一)分光光度法

一、乙酰胆碱酯酶活性抑制合成的分光光度法:乙酰胆碱酯酶活性抑制法的分光光度法接管国家规范《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的浅易魔难方式-酶抑制法》(GB／T 18630 2002)。在上述有机溶剂(或者磷酸盐缓冲液)提取并经氧化解决的溶液中，退出经色谱柱纯化的酶液O.2mL，摇匀后部署10min。退出2％(m／V)碘化硫代乙酰胆碱溶液0.2mL以及O.04％(m／V)的2，6-二氯靛酚水溶液0.1mL混匀，37℃下反映5min，测吸光值A600(0D600)，A600越大，表明农药残留量越高。A600＜0.7为未检出，A600为O.7～0.9为可能检出但残留量较低，A600＞0.9为检出。

参考资料：农药残留合成