酶活性抑制合成法（四）

二、酶活丁酰胆碱酯酶活性抑制合成的性抑分光光度法：丁酰胆碱酯酶活性抑制法的分光光度法接管国家规范《蔬菜中有机磷以及氨基甲酸酯类农药残留量的快捷检测》(GB／T 5009.199—2003)。在试管中退出用磷酸盐缓冲液提取法提取的制合蔬菜样品提取液2.5 mL(空缺对于监视加2.5 mL磷酸盐缓冲液)，而后分说加人O.1mL丁酰胆碱酯酶液以及0.1mL显色液(取160mg二硫代二硝基苯甲酸以及15.6mg NaHCO2，成法用20mL pH 8.0的酶活磷酸盐缓冲液消融)，混匀后37℃反映15min以上，性抑退出0.1mL底物液(25 mg碘化硫代丁酰胆碱溶于3mL蒸馏水)混匀，制合赶快退出比色皿中，成法用分光光度计在412nm波长下分说测定37℃反映3min样品吸光度的酶活变换值(△As)以及空缺吸光度的变换值(△A0)。合计酶活性被抑制的性抑百分率，合计公式为：

当样品提取液对于酶活性的制合抑制率低于15％时，呈现该蔬菜为牢靠或者比照牢靠；抑制率为16％～25％呈现该蔬菜为轻度传染；抑制率为26％～50％时为中度传染；抑制率≥50％呈现样品中有高剂量有机磷或者氨基甲酸酯类农药存在。成法对于清晰呈阴性服从的酶活样品需要重复检测2次以上，须要时用色谱色质联用等方式进一步测定详尽的性抑农药种类以及含量。

(二)速测卡(酶片)法

速测卡由浸渍有胆碱酯酶或者其余锐敏酶类的制合纸片(酶片)以及含酶的底物2，6-二氯靛酚乙酸酯的纸片(底物片)组成。2，6-二氯靛酚乙酸酯在胆碱酯酶的催化下能迅速发生水解反映天生蓝色的2，6-二氯靛酚，假如酶片上存在有机磷或者氨基甲酸酯类农药，胆碱酯酶活性受抑制，2，6-二氯靛酚乙酸酯不能被水解产生蓝色的2，6-二氯靛酚，底物片巩固色，如不含农药则显蓝色，其根基技术及道理与比色法相似，检测灵便度也相近。运用纸片这种重大的载体，可能达到便于照料以及现场操作的指标，不需仪器。检测历程如图6—2所示。

每一批测定应设缓冲液空缺比力。酶片浸入或者滴加样品提取液后应连结潮湿，无论是预反映10min，仍是酶片与底物片复合反映3min，反映温度最佳为37℃，温度低时应适量缩短反映光阴。

(三)薄层光谱酶活性抑制法

含农药的样品提取液在薄层板上睁开后，喷酶液至板面潮湿，在37℃、相对于湿度90％的恒温箱中部署20min，掏出后喷显色底物液，37℃保温5min，布景呈紫红色；有农药的部位因为酶活性被抑制，不能水解底物产生紫红色的产物，板上泛起红色黑点，经由黑点面积法或者薄层扫描法遏制定量合成。

(四)固相酶速测技术

速测片法常会碰着酶活性以及灵便度着落，测不出超标农药的征兆，无心甚至还产生假阴性。这是因为瓜果、蔬菜的提取物中含有良多对于乙酰胆碱酯酶具备抑制作用的杂质，这些杂质对于乙酰胆碱酯酶的抑制作用，是经由可逆性散漫来实现的，可是农药对于乙酰胆碱酯酶的抑制作用是不可逆的。因此可经由洗涤的方式把这些不同乙酰胆碱酯酶坚贞散漫的杂质去除了，要达到这一指标，酶的同定化必不可少。经由把乙酰胆碱酯酶牢靠在一种非凡的、不会以及其活性部位发生反映的载体下面，这样可能经由洗涤翦灭杂质对于酶活性的影响，从而清晰普及检测灵便度，增强酶的晃动性，便于贮存。该技术的紧张在于酶的牢靠化。用一种卵白质模板(如明胶、血清卵白、血红卵白等)作为中间体，将乙酰胆碱酯酶牢靠在特定的反对于物上(如玻璃试管等)，在牢靠好酶的试管中退出待测样品溶液，温育确守光阴后倾去样品溶液，洗涤去除了杂质，退出酶的底物以及显色剂的搅浑液。当样品中不含农药、牢靠化酶具备活性时，乙酰胆碱水解产物与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反映，反映液呈黄色；假如样品中存在对于酶起抑制作用的农药，反映液色调巩固或者显色很浅，与规范色板比力遏制定量检测。

(五)乙酰胆碱酯酶传感器

乙酰胆碱酯酶传感器是一种以牢靠化乙酰胆碱酯酶为生物锐敏部件的生物传感器。生物传感器是指由一种生物锐敏部件以及信号转换器细密配合、对于特定种类物资具备抉择性以及可逆响应的合成装置。

第一代生物传感器是将牢靠了生物活性物资(包罗酶、抗体、活性细胞或者机关、微生物等)的膜(个别是半透膜)覆被在电化学电极上而组成。第二代生物传感器是将家养分解的前言体与生物活性物资拌合后间接吸附或者共价修饰到转换器外表而组成。第三代生物传感器是将生物活性物资间接牢靠在电子元件(如半导体场效应晶体管)上组成，从而可能间接感知以及放大界面物资的变换，从而将生物识别与信号转换散漫在一起。因为生物传感器可高度被动化、微型化与集成化，在生物医学、情景监测、陆地、军事等畛域具备紧张的运用价格，特意适应于现场以及原位监测。以乙酰胆碱酯酶为生物锐敏资料的生物传感器在有机磷以及氨基甲酸酯类农药残留合成中具备较好的钻研以及开辟运用价格。

将乙酰胆碱酯酶经由丙烯酰胺异丁烯酰胺化学交联牢靠在铱电极外表制备电位型酶传感器，因为被测样品中有机磷或者氨基甲酸酯类农药浓度区别，对于乙酰胆碱酯酶活性的抑制水平的区别，使酶水解底物所产生的反映产物浓度区别，引起电极外表以及外部所产生的电位差区别，由此对于被测样品中的农药遏制定性合成以及定量合成。

接管戊二醛法将乙酰胆碱酯酶牢靠在由四氰基对于醌二甲烷修饰的丝网印刷电极外表，研制安培型乙酰胆碱酯酶传感器，而后用含少许非复原性多糖的酶晃动剂妨碍解决，在4℃冰箱保存一年后其活性无清晰变换。以乙酰胆碱酯酶传感器作调唆电极，Ag／Agcl电极作参比电极，硫代乙酰胆碱作乙酰胆碱酯酶的底物妨碍电化学合成，乙酰胆碱酯酶水解产物巯基目旦碱在电极外表氧化，产生氧化电流。

有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致氧化电流减小。电流减小的水平以抑制百分率呈现，其与有机磷农药浓度的对于数在未必畛域内呈线性关连，可患上到测定使命曲线。

式中，I0为未被农药抑制的酶电极的响应电流，I为被农药抑制后的酶电极的响应电流。

将胆碱酯酶牢靠在压电晶体外表，制备压电晶体酶传感器，可用于对于硫磷、马拉硫磷以及甲基对于硫磷的测定。

乙酰胆碱酯酶传感器可用于有机磷以及氨基甲酸酯类农药残留的测定。

八、酶活性抑制合成法存在的成果

酶活性抑制合成法应留意下述多少个主要成果。

①酶活性抑制合成法只适用于有机磷以及氨基甲酸酯类农药的检测，其灵便度有限，且有小全副农药种类对于此法很不灵便，因此对于检测服从为阴性的样品，不能觉患上就不含有农药残留或者农药残留量不超过规定规范(MRL)。

②引起酶活性抑制合成法测定误差的一个严主因素是某些样品提取物中含有干扰酶活性的杂质，从而引起测定服从的假阴性。因此对于测定呈假阴性或者可疑的样本，必须妨碍重复检测，须要时对于判断为阴性的样本进一步用色谱色质联用仪等仪器合成妨碍确证合成。

③在生物体外良多农药是酶的弱抑制剂，抉择运用适量的转化剂，使其转变为酶的强抑制剂，也是改善方式灵便度的蹊径之一。

④引起酶活性抑制法测定误差的因素尚有良多，诸如酶的晃动性、底物源头及浓度、反映温度、pH、反映光阴等，因此酶活性抑制合成法测定的重现性以及晃动性还不够事实。

为克制多因子的影响，可思考抉择适量的晃动剂以及牢靠化酶技术普及晃动性，经由基因工程伎俩钻研开辟具备优异特色的酶。

⑤因为农药的含量区别，对于酶的抑制水平区别，区别农药对于酶的抑制能耐也有差距，因此产生的色调深浅水平区别，这样就需要按区别农药、区别浓度所组成色调深浅度的区别绘制出规范色板，以便给出农药的简陋含量。在对于试验资料、检测方式等在比照试验的根基E，判断检测规范以及规范。

⑥为了削减样品提取液中的杂质干扰，开辟啰嗦易行的样品传染技术，也是削减假阴性泛起的可选方式之一。

参考资料：农药残留合成