肠道汇聚性大肠杆菌基因组脱氧核糖核酸提取方式比照与改善（三）

3.3全式金试剂盒提取汇聚性大肠杆菌基因组方式优化

接管全式金细菌基因组DNA试剂盒规范提取方式中革兰氏阴性菌提取方式妨碍汇聚性大肠杆菌基因组的肠道肠杆提取，并对于提取方式改善。汇聚核糖核酸

第一步资料解决。菌基在菌液的因组重悬液中退出200μL RB11试剂（含溶菌酶4 mg）后在37℃的孵育光阴由原来的1 h改为40min，退出卵白酶K后在55℃的脱氧提孵育光阴由原来的15 min缩短至30 min，洗脱后测定收集到溶菌酶裂解解决后的比照基因组DNA样品的纯度及浓度，见表6。改善由表可能看出，肠道肠杆经溶菌酶孵育解决后EAEC基因组DNA的汇聚核糖核酸提取量增大了近3倍。电泳合乐成果如图3所示。菌基由图可能看出，因组所提取的脱氧提基因组条带均一，无RNA传染。比照在提取历程中，改善退出试剂LB11与卵白酶K经55℃孵育30min后，肠道肠杆菌液仍十分粘稠，因此判断EAEC菌体细胞成份较为重大，可能是卵白质含量较高，退出的卵白酶K未能残缺消化菌体卵白，导致裂解液十分粘稠，无益于后续基因组DNA的提取，后续试验普及卵白酶K的用量至40 mg/L。

增大卵白酶K的用量后，菌体裂解液粘稠度清晰着落，将其转移到吸附离心柱中离心后，液体易于经由吸附膜，因此，为了普及基因组的浓度，取3倍体积菌体裂解液用于提取基因组。表7为普及卵白酶K用量后提取汇聚性大肠杆菌基因组的纯度以及浓度。由表可知，接管革兰氏阴性菌基因组DNA提取方式并增大1倍卵白酶K的用量后，汇聚性大肠杆菌基因组的浓度达到了197.7 mg/L，较规范方式提取的基因组的浓度增大了约14.5倍，但基因组纯度不普及，判断所提取的基因组中仍有卵白质等碳水化合物或者有机盐、有机试剂的传染。因为所提取的基因组DNA用于制备定性核酸规范样品，因此模板DNA的纯度对于聚合酶链式反映扩增基因组的特色基因时影响较小。琼脂糖凝胶电泳合成普及卵白酶用量后的肠道汇聚性大肠杆菌(EAEC)基因组服从如图4所示。由图可能看出，所提取的EAEC基因组条带清晰，未见降解，无RNA传染，表明该优化方式能实用普及基因组DNA的浓度。

3.4汇聚性大肠杆菌毒力基因PCR扩增检测

依据国家规范GB 4789.6—2016的方式，对于所提取的汇聚性大肠杆菌基因组妨碍检测。以所提取的汇聚性大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增其特色基因astA、aggR、pic以及uidA，并对于其扩增产物妨碍琼脂糖凝胶电泳合成，服从如图5所示。astA、aggR、pic基因为汇聚性大肠杆菌的特色毒力基因，uidA基因可在97%的大肠杆菌内检测到，4个基因的检测服从均为阴性，PCR产物条带巨细与指标片断巨细适宜，诠释所提取的基因组确为汇聚性大肠杆菌基因组。尽管所提取基因组的纯度指标A260/A2 8 0以及A260/A2 3 0均未达到1.8，可是依据毒力基因扩增服从可知，所制备的基因组样品对于定性核酸规范样品的检测服从无影响，可用于制备定性核酸规范样品。

4论断

比力运用多种细菌基因组DNA提取试剂盒提取EAEC基因组的提取成果可知，因为EAEC细胞裂解液十分粘稠，无益于后续的基因组提取，因此提取到的EAEC基因组的浓度及纯度均十分低。4种试剂盒中全式金试剂盒提取步骤啰嗦，耗时少，因此对于该试剂盒提取历程妨碍优化。经由削减30 min的溶菌酶孵育、1倍卵白酶K的用量及2倍体积的菌体裂解液，EAEC基因组的提取浓度普及了14.5倍，以所提取的基因组为模板，PCR检测EAEC的特色毒力基因，服从呈现3个特色毒力基因均为阴性，知足用于制备食物检测用核酸定性参考物资的要求。本文中的钻研为少许提取核酸定性规范样品的前期样品奠基了根基，同时也为基因组提取难题的细菌基因组的提取方式探究提供了参考。

申明：本文所用图片、翰墨源头《济南大学学报》第35卷第2期，版权归原作者所有。如波及作品内容、版权等成果，请与本网分割

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