水产物糜烂希瓦氏菌冷激卵白的结构与功能合成（一）

水产物口感鲜美、水产营养充实，物糜瓦氏深受斲丧者的烂希兴致，可是菌冷激卵结构，水产物极易糜烂蜕变，合成造成重大的水产经济损失。因为微生物的物糜瓦氏愿望以及入侵是导致水产物糜烂的主要因素，因此水产物的烂希保鲜历程中对于微生物的抑制十分紧张。高温保鲜技术是菌冷激卵结构运用最先，也是合成运用最广的水产物保鲜技术。高温会使微生物的水产心理性能发生紧张的变换，好比膜行动性着落，物糜瓦氏核酸二级结构晃动性增强，烂希转录、菌冷激卵结构翻译及卵白折叠的合成功能降高档。在高温下有些微生物仍能以未必的愿望速率愿望，纵然愿望较慢。糜烂希瓦氏菌是一种耐冷菌，在0℃下也能愿望、孳生，其在有氧冷冻或者冷藏状态下是多种水产物的特定糜烂菌，引起冷藏水产物的糜烂蜕变，这严正着落了水产物的品质，极有可能导致食物牢靠成果。鉴于水产物保鲜的紧张经济价格，深入清晰糜烂希瓦氏菌高以及适应的份子机制，可能辅助预料糜烂菌在冷藏食物中的行动，便于妨碍更精确的危害预料以及提防。

钻研发现，微生物在高温浸染下会产生冷应激反映，天生一系列的抗高温卵白，称为冷激卵白。细菌冷激卵白是一类包罗核酸散漫冷休克结构域的高度激进的小份子卵白（～7.4ku），可能作为份子同伙与单链DNA或者单链RNA散漫，克制DNA或者RNA在高温下组成二级结构，从而增长转录以及翻译。此外，冷激卵白还退出细菌的多个心理生化历程，如：细胞膜的行动性，细菌个别愿望与分解，营养胁迫，细菌的毒力等。冷激卵白对于细菌在高温时复原愿望以及发挥细胞种种功能是十分紧张的，是剖析微生物高以及适应机制的紧张卵白。可是，当初对于糜烂希瓦氏菌冷激卵白的钻研鲜有报道。

细菌个别具备多个冷激卵白，且冷激卵白的浸染纪律十分重大，并非所有冷激卵白都受高温诱导表白。经由对于NCBＩ数据库中糜烂希瓦氏菌模式菌株的全基因组序列检索，发现糜烂希瓦氏菌中存在3个典型冷激卵白，当初尚未发现无关其主要冷激卵白及相干功能的钻研。本文以水产物的糜烂希瓦氏菌为钻研工具，经由PCR扩增取患上水产物糜烂希瓦氏菌的3个冷激卵白基因序列，在此根基上经由生物信息学合成糜烂希瓦氏菌冷激卵白的理化性子、结谈判功能特色等，旨在为冷激卵白在糜烂希瓦氏菌高以及适应历程中的功能钻研，以及对于水产物中糜烂希瓦氏菌的抑制提供参考。

1 资料与方式

1.1 资料与试剂

糜烂希瓦氏菌为本试验室自糜烂的冷藏大菱鲆中别离所患上，于-80℃收藏。聚合酶链式反映（Polemerasechainreaction，PCR）引物拜托生工生物工程（上海）技术服务有限公司分解

EasyTaqRDNAPolymerase，北京全是金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、GeneRed核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司；Biowest琼脂糖、LB营养琼脂、LB营养肉汤，青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与配置装备部署

防蒸发梯度PCR，美国Eppendrof公司；凝胶电泳及配套配置装备部署，美国Bio-Bad公司；微量冷冻离神思，美国Thermo公司。

1.3 菌种判断及冷激卵白基因的克隆与测序

活化本试验室收藏的糜烂希瓦氏菌，遵照基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取基因组DNA，运用细菌16SrRNA基因通用引物27F以及1492R妨碍PCR扩增，取患上糜烂希瓦氏菌的16SrRNA基因（表1）。接管NCBＩ检索近缘糜烂希瓦氏菌菌株基因组信息（GenBank：CP002457.1），依据诠释冷激卵白基因及其上、鄙俚序列，妄想引物（表1），妨碍冷激卵白的Csp1589，Csp1376以及Csp2252基因的扩增。PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，Tm℃30s（详见表1），72℃45s，循环30次。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工测序。

1.4 系统发生树的构建

自NCBＩ数据库取患上大肠杆菌（NC_000913.3）的9个冷激卵白（CspA～Ｉ），以FASTAfile方式保存。经由软件ClustalX对于测序所患上糜烂希瓦氏菌冷激卵白以及大肠杆菌的冷激卵白妨碍序列比对于，并用Mega7.0中的毗邻法（Neighbor-jioningmethod，NＪ）为其构建系统发生树，步长值（Bootstrapvalues）为1000。

1.5 冷激卵白的理化性子及结构域的预料

ExPASy网站中的一个工具ProtParam来预料糜烂希瓦氏菌冷激卵白的根基心理、生化特色，用PSORTwwwServer中的PSORTPrediction工具预料冷激卵白细胞定位，用TMHMMServer2.0预料冷激卵白跨膜区域，用SignalＩP5.0在线预料冷激卵白信号肽，用SMART预料冷激卵白结构域的组成及其功能，用在线软件NCBＩConservedDomainSearch妨碍其氨基酸激进序列合成。

1.6 结构预料与模子品质评估

运用PSＩPRED预料糜烂希瓦氏菌冷激卵白的二级结构。将糜烂希瓦氏菌冷激卵白的氨基酸序列提交到SWＩSS-MODEL网站妨碍三级结构的预料。将构建的卵白三级模子用PROCHECK以及Ｖerify3D妨碍品质评估。PROCHECK以及Ｖerify3D是SAＶESv5.0中的结构评估服务。

1.7 互作卵白及配体散漫位点的预料

用STRＩNG工具判断在活体内与糜烂希瓦氏菌冷激卵白存在相互浸染的卵白。这种相互浸染既包罗卵白质之间间接的物理相互浸染，也包罗卵白质之间间接的功能相干性。将从SWＩSS-MODEL患上到的模子文件输入COACH，以预料糜烂希瓦氏菌冷激卵白潜在的配体散漫位点。

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