用于作育基愿望率评估的大肠杆菌规范物资研制（一）

为知足快捷功能评估微生物作育基愿望率的用于需要，提出一种新的作育资研制微生物规范物资研制思路，并研制出具备2种特色量值的基愿菌规大肠杆菌规范物资。研制历程中同时运用平板计数琼脂（plate count agar,望率PCA）作育基以及结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar,VRBA）作育基妨碍平均性评估、晃动性评估、评估6家试验室相助定值以及不断定度评定。肠杆试验服从表明：大肠杆菌规范物资的范物平均性以及晃动性优异，可能在–20℃下晃动保存6个月。用于该规范物资基于PCA作育基的作育资研制规范值为(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA作育基的基愿菌规规范值为(6.1±1.0)×103 CFU/g。运用该规范物资对于多个PCA作育基以及VRBA作育基的望率愿望率妨碍评估，评估服从以及国标方式有很好的评估相干性。综上所述，肠杆研制的范物大肠杆菌规范物资可能用于多种作育基的愿望率评估，具备不便快捷的用于短处。

0 引言

食物微生物魔难是构建我国食物牢靠以及生物牢靠系统的紧张反对于以及保障。而菌落总数以及大肠菌群指标是食物微生物魔难中最根基、最罕有的检测名目。国家规范规定菌落总数以及大肠菌群的检测分说需要平板计数琼脂（plate count agar,PCA）作育基以及结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar,VRBA）作育基，因此这两种作育基的品质间接影响菌落总数以及大肠菌群检测服从的精确性。PCA作育基以及VRBA作育基的品质操作也受到了微生物钻研机构、检测机构、斲丧厂家的高度重视。

愿望率是作育基品质操作的紧张指标之一。现行的愿望率评估方式来自国标GB 4789.28—2013《食物牢靠国家规范食物微生物学魔难作育基以及试剂的品质要求》。该规范规定，PCA作育基以及VRBA作育基的愿望率评估都需要运用大肠杆菌作为质控菌株。质控菌株经由昏迷以及作育后，分说接种到待测作育基以及参比作育基妨碍作育计数，且每一个平板的接种水平需要操作在20～200 CFU之间。该方式省事费劲，重复性以及再现性有待普及。针对于现行评估方式的弱点，本名目组在以前的钻研中提出一种基于微生物规范物资的愿望率评估方式，即用于接种的质控菌株以规范物资的方式存在。该方式可能清晰削减使命量、实用普及接种数目的精确性，并将光阴延迟至1天之内。鉴于此，为了快捷功能评估PCA作育基以及VRBA作育基的愿望率，需要研制量值精确、平均晃动的大肠杆菌规范物资。

微生物计数服从具备较高的作育基依附性。以大肠杆菌为例，对于立大肠杆菌样本在区别种类作育基上可能患上到差距清晰的计数服从。当初我国仅有的3个有证大肠杆菌规范物资GBW(E)09109四、GBW(E)09109五、GBW(E)091096都是基于单种作育基遏制定值以及运用的。这3个规范物资难以知足PCA作育基以及VRBA作育基愿望率评估的需要。

综上所述，本文选用大肠杆菌规范菌株作为评估菌株，将其制备陋习范物资。同时运用PCA作育基以及VRBA作育基妨碍多家试验室相助定值，并对于其平均性、晃动性以及不断定度妨碍评估或者评定。研制的大肠杆菌规范物资将具备两种特色量值，可能用于PCA作育基以及VRBA作育基愿望率的评估。

1 资料与方式

1.1 试验资料

1.1.1 菌株

大肠杆菌：菌株号ATCC 25922，中国工业微生物菌种收藏中间。

1.1.2 主要作育基

PCA作育基：品牌分说为北京陆桥、广东环凯、青岛海博、美国BD、英国Oxoid，随机编号为A一、A二、A三、A四、A5。

VRBA作育基：品牌分说为北京陆桥、广东环凯、青岛海博、美国BD、英国Oxoid，随机编号为B一、B二、B三、B四、B5。

1.1.3 仪器

冻干机：Genesis SQ e L-85型，美国SP Scientific公司；电子天平：BS224S型，德国赛多利斯公司；离神思：1-14型，德国赛多利斯公司；恒温振荡作育箱：HZQ-X100型，江苏太仓市试验配置装备部署厂；恒温作育箱：DNP-9272型，上海精宏试验配置装备部署有限公司；去离子水机：Mill Q型，德国默克公司；低压灭菌锅：HG-50型，日本Hirayama公司。

1.1.4 试剂

磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution,PBS,p H 7.2±0.2）、营养肉汤作育基、胰卵白胨大豆琼脂（tryptose soya agar,TSA）作育基：北京陆桥技术有限责任公司；脱脂奶粉：美国BD公司；海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠、麦芽糊、抗坏血酸钠：合成纯，Sigma公司；西林瓶：规格为8 m L，深圳市宝安区沙井博海玻璃废品厂。

1.2 大肠杆菌规范物资的制备与测定方式

依据本试验室先前的制备工艺制备大肠杆菌规范物资。将大肠杆菌规范菌株接种于营养肉汤作育基，37℃、200 r/min作育12 h。随后10 000g离心5 min，弃去上清液，菌泥用PBS重悬并稀释，患上到适量浓度的大肠杆菌菌液。参考先前的配方配制呵护剂，退出大肠杆菌菌液后，将呵护剂分装至棕色西林瓶中。分装竣事，将西林瓶转移至冻干机内妨碍冻干。冻干结束将样品压盖密封，患上到大肠杆菌规范物资200个单元，规格为0.5 g/瓶。

运用PCA作育基或者VRBA作育基测定例范物资的方式参考GB 4789.2—2016《食物牢靠国家规范食物微生物学魔难菌落总数测定》或者GB4789.3—2016《食物牢靠国家规范食物微生物学魔难大肠菌群计数》第二法。运用天平称量4.5 g无菌蒸馏水复溶规范物资，而后用PBS对于样品匀液妨碍10倍系列稀释。抉择3个适量稀释度，每一个稀释度分说排汇1 m L样品悬液接种于无菌平皿，每一个稀释度至少重复3次。接下来运用PCA泼洒平板法或者VRBA泼洒平板法妨碍大肠杆菌数目的测定。

1.3规范物资平均性评估

依据JJF 1343—2012《规范物资定值的通用原则及统计学道理》的要求，遵照随机抽样原则对于规范物资的平均性妨碍评估。随机抽取11个单元的规范物资，分说运用PCA泼洒平板法以及VRBA泼洒平板法对于每一个单元规范物资的大肠杆菌数目妨碍测定，每一瓶样品重复检测3次。

1.4 规范物资晃动性评估

晃动性审核主要波及规范物资在运输历程中的晃动性、客户真个贮存条件以及运用实用期。首先，对于规范物资的短期晃动性妨碍评估。魔难温度分说为–20℃以及4℃，审核光阴为7 d（分说为第0,1,3,5,7 d）。每一次从–20℃以及4℃下分说抽取3个单元的规范物资，运用PCA作育基以及VRBA作育基妨碍大肠杆菌数目测定。接下来，遵照先密后疏的原则，对于规范物资的临时晃动性妨碍评估。临时晃动性魔难温度为–20℃，审核光阴为6个月（分说为第0,1,2,4,6个月）。每一次从–20℃抽取3个单元，运用PCA作育基以及VRBA作育基妨碍测定。

1.5 规范物资的定值

依据JJF 1343—2012以及CNAS-GL29—2010的要求，规范物资经由6家经由CNAS认可的试验室相助定值。每一家试验室分说运用PCA作育基以及VRBA作育基测定3个单元的规范物资，每一个规范物资重复丈量3次，丈量方式参考1.2节。大肠杆菌规范物资的规范值为6家试验室丈量服从的平均值。

1.6 评估PCA作育基以及VRBA作育基的愿望率的方式

运用PCA（或者VRBA）作育基，对于一个单元的大肠杆菌规范物资妨碍3次重复丈量，并依据下式合计大肠杆菌在该作育基上的愿望率：

式中：PR——待测PCA（或者VRBA）作育基的愿望率；

NS-3次运用PCA（或者VRBA）作育基测定例范物资的平均服从；

N0——大肠杆菌规范物资基于PCA（或者VRBA)作育基的规范值。

大肠杆菌规范物资基于PCA作育基的规范值为(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA作育基的规范值为(6.1±1.0)×103 CFU/g（见2.4定值服从的不断定度评定）。因此运用PCA作育基测定大肠杆菌规范物资的服从NS应大于6.0×103 CFU/g，运用VRBA作育基的测定服从NS应大于5.1×103 CFU/g。即待测PCA作育基的愿望率应知足PR≥0.84的要求；待测VRBA作育基的愿望率应知足PR≥0.83的要求。

1.7 区别品牌作育基愿望率的评估

依据GB 4789.28—2013[9]的规定，PCA作育基以及VRBA作育基的参比作育基均为TSA作育基。运用区别品牌的PCA作育基（A1～A5）以及VRBA作育基（B1～B5）、以及参比作育基TSA，分说对于3个单元的大肠杆菌规范物资妨碍测定。依据式（1）合计待测PCA作育基以及VRBA作育基的愿望率。同时参考国标方式，合计作育基的愿望率，待测作育基的愿望率为该作育基的测定服从与TSA的测定服从的比值。

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