一种功能、精确测定油菜中维生素C含量的方式（一）

油菜（BrassicanapusL.）属于芸薹科（Brassicaceae）芸薹属（Brassica），种功是确测我国主要的油料作物。随着2015年国家油菜籽临时收储政策的定油的方作废以及外洋进口攻击的影响，油菜斲丧的菜中比照效益严正着落，在很洪流平上影响了我国农人种植油菜的维生被动性。甘蓝型油菜是素C式由甘蓝以及白菜经由人造杂交后再加倍后组成的，其两个后人都是含量深受广漠斲丧者兴致的适口蔬菜，历源头与进化的种功角度来看，将油菜开辟为蔬菜具备优异的确测迷信根基以及重大的后劲。近些年来在浙江、定油的方湖北、菜中湖南、维生江苏等长江流域主产区，素C式看风使舵总结出“菜用+油用”、含量“菜用+花用+油用”等多种油菜功能运用开辟模式。种功有钻研表明，在适量的种植条件下，收获油菜薹后并不会对于油菜籽的产量造成清晰影响，此模式可实用削减农人种植油菜的斲丧效益。在长江流域油菜主产区，油菜作为夏日作物，不会影响到主要食粮作物的种植。运用冬闲田种植油菜，接管油蔬两用技术(即先割菜薹，后收菜籽)，对于降职油菜种植的部份效益，削减农人支出，增长我国油菜工业发展具备紧张意思。

油菜幼苗（5叶期）以及油菜薹中都含有充实的维生素C以及此外营养物资，具备很高的食用价格。作育高维生素C油菜薹种类，既可降职油菜薹的菜用价格，也可为斲丧者提供瘦弱营养的功能型蔬菜。维生素C又称为抗坏血酸，是人体必须的主要维生素之一。对于一个平凡成年人，人体所需的绝大少数此外维生素伙食推荐提供量都在20mg/d如下，而维生素C的伙食推荐提供量却为100mg/d，是人体中需要量最大的一种维生素，当人体严正缺少维生素C时会引起坏血病，还会造成人体免疫力的着落。维生素C是蔬菜以及瓜果中最罕有的抗氧化剂，退出人体内的多种氧化复原反映。有钻研表明，维生素C不光可能防御癌症，削减癌症的发生率，还可能改善以及普及人体的免疫功能，同时具备防御血汗管疾病的紧张功能。人体自身无奈分解维生素C，必须要重别致的蔬菜、瓜果等食物中获取。精确并快捷地测定出食物中的维生素C含量，对于保障人体同样平凡维生素C的摄入具备紧张意思。

当初测定食物中维生素C含量的检测方式主要有：碘酸钾滴定法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法、紫外分光光度法、功能液相色谱法等，但大多操作啰嗦、测定功能不低等成果。在现行规范GB5009.86-2016中规定了功能液相色谱法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法为测定食物中抗坏血酸的方式，其中2,6-二氯靛酚滴定法，操作重大，可是假如样品中有色素等物资会对于滴定服从造成影响；荧光法耗时较长；而功能液相色谱法是一种重大、功能、精确的测定方式。但当初国标中的功能液相色谱法接管的样品前解决比照啰嗦，一个样品从解决到上机检测至少需要15min，测定功能不高。在对于大群体样本的维生素C妨碍检测时，若何快捷并精确筛选出高维生素C含量资料，普及维生素C检测方式的功能就显患上尤为紧张。

维生素C是一种水溶性维生素，份子式为C₆H₈O₆，份子中相邻的两个羟基极易发生分解并监禁出H⁺，呈酸性并具备很强的复原性，导致维生素C极其不晃动。况且维生素C在常温条件下易降解，样品的蕴藏条件影响检测服从的精确性。为此本钻研在国标的根基上优化了测定维生素C的功能液相色谱法，改善后的方式可快捷精确地测定样品中维生素C的含量，同时运用液氮蕴藏并研磨油菜样品，使患上该方式可操作期长、检测服从重复性好、精确灵便、接管率高，能临时保存，可用于大群体样本中维生素C的合成判断及遗传剖析，为进一步钻研油菜中维生素C的分解以及遗传机制奠基了方式根基，有利于作育富含维生素C的油菜新种类。

1 资料与方式

1.1 资料

2018年10月至11月在中国农业迷信院油料作物钻研所阳逻试验基地所取的油菜幼苗（甘蓝型油菜分割关连群体资料，取样时期为收获后30d左右）以及小白菜（兔子腿矮脚黄）、生菜（意大利整年耐抽薹生菜）、菠菜（大圆叶菠菜）（每一种蔬菜的取样光阴均处于可食用状态）。每一种油菜抉择5株巨细相近的资料（去掉油菜的根部以及全副黄叶），小白菜、生菜、菠菜同样各取巨细相近的5株（去掉蔬菜的根部以及全副黄叶）。

1.2 仪器与试剂

功能液相色谱仪（e2695，美国Waters公司）、PDA检测器（2998，美国Waters公司）、色谱柱（C18柱，柱长250nm，内径4.6nm，粒径5μm，美国Waters公司）、瓶口分液器（5-50mL，德国Eppendorf公司）、万分之一天平（JJ124BC，常熟市双杰测试仪器厂）、十万分之一天平（AUW220D，日本岛津公司）、均质机（AD500S-P，上海昂尼仪器有限公司）、超声波洗涤机（SB25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）、真空抽滤装置（DET-01P，达尔拓公司）、多功能破碎捣毁机（JYS-M01，九阳股份有限公司）。

盐酸（优级纯，国药总体化学试剂有限公司）、超纯水（色谱纯，Rephile-watersystem)、维生素C规范品（纯度99%以上，德国Sigma-Aldrich公司）、乙酸铵（优级纯，德国Sigma-Aldrich公司）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。
尼龙66（Nylon）滤膜（直径25妹妹、孔径0.45μm，天津市津腾试验配置装备部署有限公司）、尼龙66（Nylon）滤膜（直径13妹妹、孔径0.22μm，天津市津腾试验配置装备部署有限公司）、微孔水相滤膜（直径50妹妹、孔径0.25μm，天津市津腾试验配置装备部署有限公司）、2mL色谱进样瓶（上海安谱试验科技股份有限公司）、内插管（250μL，上海安谱试验科技股份有限公司）。

1.3 方式

1.3.1 溶液的配制

提取液（1%HCl溶液）的配制：用移液枪排汇10mL盐酸（优级纯）于1000mL容量瓶中，加超纯水定容，摇匀后备用。
行动相（20妹妹ol/L的乙酸铵）：用万分之一的天平称取1.54g乙酸铵，消融于200mL的超纯水中，超声15min后，再用超纯水定容至1000mL后不断超声脱气15min。超声结束后用真空抽滤泵过微孔水相滤膜（0.22μm）妨碍抽滤，过滤后的溶液装入行动相瓶中备用。为防御因行动相的原因影响检测服从的精确性，20妹妹ol/L的乙酸铵需现配现用。

维生素C规范溶液(1000μg/mL)：用十万分之一的天平精确称取0.1g维生素C规范品于100mL棕色容量瓶中，用1%的盐酸消融并定容，短缺摇匀后部署在4℃冰箱中避光保存。

1.3.2 鲜样品的前解决

用万分之一的天平精确称取2g别致油菜或者蔬菜样品的叶片，置于50mL离心管中，并退出40mL提取液（即1%的HCl），用均质机将样品残缺均质破碎。用5mL注射器排汇已经均质的样品匀浆，过两层滤膜（0.45μm+0.22μm），滤液过滤到250μL的内插管中，待上机检测。

样品贮存：将别致油菜或者蔬菜样品分说蕴藏在4℃、-20℃、液氮（-196℃）条件下。3d后，将蕴藏在4℃、-20℃的一全副样品放入液氮中速冻，用多功能破碎捣毁机磨成粉末状（用以前先用液氮妨碍预冷），并置于50mL离心管中；残余样品不断止研磨解决，间接称取2g样品，此外解决方式以及检测方式相同。测定出区别蕴藏条件以及区别解决方式下油菜以及蔬菜样品中维生素C的含量。

1.3.3 功能液相色谱仪（HPLC）的检测条件

色谱柱，美国WatersXBridge-C18色谱柱；行动相，甲醇以及20妹妹ol/L乙酸铵（两者比例为7:93）；流速，1.0mL/min；进样量，10μL；指标柱温，25℃；检测波长，245nm；维生素C的保存光阴，2.7min。

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