马铃薯块茎以及土壤样品中粉痂病菌快捷 检测方式的建树（二）

1.4 引物特同性检测

引物 A5/A九、马铃C3/C8 对于马铃薯粉痂菌基因组DNA及其余 11 个非靶标菌株基因组 DNA妨碍平凡 PCR；引物 QF/QR 对于马铃薯粉痂菌基因组 DNA 及其余 11 个非靶标菌株基因组DNA 妨碍荧光 PCR，薯块式ddH2O 作为阴性比力，茎及痂病菌快捷检建树检测引物的土壤特同性。平凡 PCR 反映系统（50 μL）为：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，样品上鄙俚引物（0.1 μmol·μL^-1）各 0.5μL，中粉模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，测方ddH2O 23.5 μL。马铃

扩增条件为 94 ℃预变性5min，薯块式94 ℃变性45s，茎及痂病菌快捷检建树55℃退火30s，土壤72 ℃缩短45 ，样品35个循环；72℃填补缩短 10min。中粉荧光 PCR 反映系统（20 μL）为：2×SuperReal PreMix Plus 10μL，测方上鄙俚引物（0.1 μmol·μL^-1）各 0.5 μL，马铃50×ROX Reference Dye 0.4 μL，模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，ddH2O 8.1 μL。荧光 PCR 反映条件为 95℃预变性 15 min，95℃变性 10 s，60℃退火 32 s，40 个循环。

1.5 重组质粒的制备

马铃薯粉痂菌特同性引物 QF/QR 的扩增产物经接管纯化后，与 pEASY®-T1 载体于 25℃衔接，转入大肠杆菌 Trans1-T1 体味态细胞中。排汇菌液平均涂布在含有氨苄青霉素的 LB固体平板上，37℃作育 24 h。挑取阴性克隆，转入含有氨苄青霉素的 LB 液体作育基中，37℃、180 r·min^-1振荡作育12 h后，提取重组质粒并妨碍PCR扩增，扩增产物送至北京博迈德生物公司测序，验证是否精确插入指标片断。用测定质粒 DNA 浓度以及纯度，依据摩尔定律，合计单元体积质粒所含的 DNA 拷贝数浓度。质粒拷贝数=[质粒浓度（ng·μL^-1）×质粒体积（μL）×6.02×1023]/[（载体长度 bp+片断长度 bp）×660 g·mol^-1]

1.6 灵便度检测运用

NanoDrop 2000 紫外分光光度计，测定马铃薯粉痂病菌质粒 DNA 浓度，再以 10倍梯度稀释，分说妨碍平凡 PCR 以及实时荧光定量 PCR 扩增，依占有无扩增条带及荧光信号值巨细，检测其灵便度。

1.7 规范曲线建树

将阴性重组质粒 DNA 妨碍 10 倍梯度稀释，运用引物 QF/QR 妨碍荧光定量 PCR 扩增。规范曲线的横坐标以及纵坐标分说设定为质粒浓度对于数值以及循环阈值，运用 Excel 2010 软件构建马铃薯粉痂菌荧光定量 PCR 规范曲线。

1.8 田间土壤及抱病块茎机关样品检测及验证

分说从云南省邵通市、甘肃省定西市以及河北省张家口市网络 18份带菌土壤以及18 份带菌种薯样品，遵照 1.2 中的方式提取动物机关样品总 DNA，妨碍平凡 PCR 以及荧光 PCR 检测，
合计检出率。

2 服从与合成

2.1 引物特同性验证

运用引物 A5/A9 以及 C3/C8 对于马铃薯粉痂病菌以及此外 11 株非靶标病原真菌基因组 DNA妨碍老例 PCR 扩增，服从呈现仅马铃薯粉痂病菌 DNA 扩增出 281 以及 391 bp 的指标条带，而此外供试菌株 DNA 以及清水比力未扩增出条带（图 2）。运用引物 QF/QR 妨碍实时荧光定量 PCR 扩增，服从表明该引物仅对于马铃薯粉痂病菌有仅有的产物罗致峰（图 3）。

2.2 灵便度检测

运用引物 QF/QR 对于区别浓度质粒 DNA 妨碍老例 PCR 以及荧光定量 PCR 扩增，服从表明老例 PCR 灵便度为 1.38×104 fg·μL^-1，荧光定量 PCR 灵便度为 13.8 fg·μL^-1，是老例 PCR检测灵便度的 1000 倍（图 4）。

2.3 规范曲线的建树

以区别稀释浓度的质粒DNA为模板，运用引物 QF/QR 妨碍荧光定量 PCR 扩增，服从表明，荧光 PCR 熔解峰单峰，规范曲线为 y=-3.8939x+35.228，R2=0.9966，该系统线性关连优异（图 5）。

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