HPLC同步测定秃疮花中紫堇丁碱同分异构体的含量（一）

钻研HPLC同步测定秃疮花中紫堇丁碱同分异构体含量的同步秃疮同分体方式。接管工业乙醇超声辅助法提取秃疮花全草干粉制患上乙醇提取物,测定用等量煤油醚以及氯仿溶剂挨次萃取,氯仿相接管柱层析法同步别离患上到紫堇丁碱同分异构体,接管HPLC测定其含量。

色谱条件:接管HPLC (E2695 Waters,花中含量 1525-2707 TCM-2489)、柱型C18 (250 妹妹×4.6妹妹,紫堇 5μm),甲醇(A)-水(B)为行动相,梯度洗脱(0～5 min, 10%A; 5～35 min, 10%A→100%A; 45～48 min, 100%A→10%A, 48～50 min, 10%A),上样量1 mL,进样体积10μL,每一个样品运行检测光阴50 min;柱温30℃,检测波长260nm。服从表明,丁碱秃疮花中紫堇丁碱含量为0.79%,异紫堇丁碱含量为1.33%。紫堇丁碱以及异紫堇丁碱是异构秃疮花酸化氯仿相的主要活性成份,其同步富集工艺及HPLC同时检测方式未见报道,试验为定量测定药食同源动物中单体化合物的含量奠基试验根基以及事实依据。

秃疮花[Dicranostigma leptopodum(maxim.)Fedde,同步秃疮同分体DLF]，又名滇川秃疮花、测定秃子花、花中含量红茂草、紫堇勒马回（陕西），丁碱属于罂粟科秃疮花属。异构带根全草民间供药用，同步秃疮同分体春夏网络，测定晒干；性凉，花中含量苦涩味，有毒；有清热解毒、消肿止痛、杀虫的成果；用于治疗扁桃体炎、牙痛、咽喉痛、淋巴结核，主治咽喉痛、扁桃体炎、齿龈肿痛、秃疮、瘰疬、疖疮、平凡疣、疥癣、痈疽、头癣、体癣等。

今世药理钻研证实，传统中草药秃疮花提取物具备抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、杀虫等多种药理活性]。秃疮花化学成份主要为多种异喹啉类生物碱。其中，生物碱包罗阿朴啡型、原小檗碱型、原阿片碱型，对于癌细胞系如SMCC-772一、A54九、HT-2九、KB以及p388等癌细胞具备较强的细胞毒性，可抑制癌细胞增殖，可能是秃疮花抗肿瘤活性的物资根基。

工艺钻研指出异紫堇丁碱在该动物中的含量较高[7]，而且具备强的抗肿瘤活性。可是无关同步提取别离以及HPLC同步测定紫堇丁碱同分异构体的方式未见文献报道。试验接管超声提取法以及硅胶柱层析法别离纯化紫堇丁碱以及异紫堇丁碱，经由HPLC同时测定其含量，以期为秃疮花的实用运用以及资源开辟提供迷信依据。

1 资料与方式

1.1 试验资料

秃疮花为花期全草，2018年5月采自陕西省西北农林科技大学北校园区。经由西北农林科技大学苗芳传授判断为秃疮花（Dicranostigma leptopodum(Maxim.)Fedde）。人造风干，破碎捣毁后用孔径0.150 妹妹筛筛分，密封，4℃冰箱保存备用。

1.2 主要试验试剂

甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、煤油醚、氨水、氢氧化钠等（合成纯，天津市津东天正详尽化化学试剂厂，天津市富宇详尽化工有限公司）；48～74μm氧化铝、GF254薄层层析硅胶、74～149μm以及48～74μm柱层析硅胶（青岛陆地化工场）；0.5%CMC、110℃活化GF254薄层层析硅胶（自制）；羧甲基纤维素钠（CMC）（南京化学试剂公司）；75%乙醇、95%工业乙醇（山东安捷高科公司）；色谱纯甲醇（德国默克）；超纯水（上海以及泰）。

1.3 主要试验仪器

KQ-500DE型数控超声洗涤器（昆山市超声仪器有限公司）；JPCT-20L型超声提取器（无锡久平仪器有限公司）；WFH-203三用紫外合成仪（上海光谱仪器有限公司）；BC-R206型旋转蒸发器（上海贝凯生归天工配置装备部署有限公司）；DZF-6051型真空去世板箱（上海精宏试验配置装备部署有限公司）；HPLC(Waters公司）；C-18反相色谱柱（Merk公司）；CP224C万分位电子合终日平（奥豪斯仪器常州有限公司）；YP30002电子天平（上海越平迷信仪器苏州制作有限公司）。

E2695 Waters功能液相色谱仪；1525-2707 TCM-2489色谱系统（Water 1525 Binary HPLC Pump,Water2707 Autosampler,Water 2489 UV/Visible Detector）；柱型C18(250 妹妹×4.6 妹妹,5μm),Breeze电脑挨次系统。

1.4 提取别离试验方式

将秃疮花全草药材去世板破碎捣毁，取其干粉400 g，用2 000 m L体积分数95%乙醇，在常压下遵照1︰5(g/m L）的固液比超声波提取3次，45℃，每一次1 h，过滤，并吞滤液，50℃减压接管溶剂，制患上乙醇提取物用水短缺混悬后，挨次用极性由小到大的区别溶剂萃取。用等量煤油醚溶剂陆续萃取3次，搅浑萃取液，并减压蒸馏作废煤油醚溶剂，患上煤油醚萃取相浸膏，残余水相，退出盐酸妨碍酸化（p H 1～2），用等量氯仿溶剂萃取3次，并吞萃取液，减压作废氯仿溶剂，患上酸化氯仿相。取1.00 g秃疮花酸化氯仿相，用48～74μm硅胶柱层析以及中性Al2O3柱层析（规格：35 妹妹×280 妹妹），洗脱剂挨次为V(CHCl3）︰V(CH3OH)=15︰1～8︰1，别离患上到196.9 mg紫堇丁碱以及488.6 mg异紫堇丁碱[8]。紫堇丁碱占酸化氯仿相的19.7%，异紫堇丁碱占酸化氯仿相的48.9%，两者合计共占酸化氯仿相的68.6%，是酸化氯仿相的主要实用成份。

2 含量测定

2.1 供试样品及浓度配制

实时提取物：称取5 g秃疮花全草粉末，用95%工业乙醇，于50℃超声提取，提取3次，每一次1 h，制患上0.855 g醇提物，命名为TCH-1。

秃疮花中生物碱类化合物紫堇丁碱（Cor）、异紫堇丁碱（Iso-Cor）均为钻研别离、提取以及纯化的单体化合物。

称取响应量的醇提物以及单体化合物，用色谱甲醇消融，并用0.22μm超滤膜过滤，配制成响应浓度的甲醇溶液。生物碱单体化合物浓度以及醇提物浓度配制梯度见表1以及表2所示。

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