响应面法优化绿豆抗氧化肽的制备工艺（一）

随着人们对于从容基性命钻研的面法不断关注，氧化应激伤害以及抗氧化呵护浸染的优化艺钻研成为热门。因人体中抗氧化的绿豆物资有限当氧化剂与人体内抗氧化剂患上到失调时，人体味处于氧化应激状态。抗氧当体内的化肽氧化剂浓度超过细胞攻击能耐时，氧化伤害可引起如癌症，备工高发性软化症以及血汗管疾病等疾病。面法当初最罕有的优化艺是化学抗氧化剂，但因其有未必的绿豆毒副浸染以是运用受到限度。近些年来钻研发现，抗氧由卵白酶水解制患上的化肽生物活性肽具备未必的抗氧化能耐，水解出的备工抗氧化肽与大份子卵白质比照，显具备更高的面法生物活性，抗氧化肽在体内积攒具备翦灭从容基以及抑制脂质过氧化的优化艺功能，可能连结机体内从容基的绿豆失调，从而普及机体抗朽迈以及抗疾病的能耐。抗氧化肽因其具备牢靠、功能、易罗致等特色，在保健、医疗等畛域受到了管饭的重视。

绿豆又名青小豆，属于医食两用作物，是我国主要的食粮作物之一，在天下多区域种植，年均产量在6l万吨且富含高品质的动物卵白，是低劣的食物加工质料。食用绿豆益处繁多，如可能着落血脂、普及机体免疫力、防御朽迈以及具备抗氧化等浸染。绿豆多肽中的抗氧化活性肽相对于份子品质小，具备优异的水溶性、低黏度、晃动性强，是人造的抗氧化剂，可能起到翦灭体内从容基、抑制生物大份子物资过氧化的浸染，具备延缓朽迈、防御疾病等短处，有很高的运用价格。但就当初而言，绿豆抗氧化多肽的制备工艺钻研较少，不能知足现阶段的需要，斲丧老本较高，制备工艺不太成熟，对于绿豆多肽提取的钻研有侧紧张意思。

一、资料与方式

一、资料及试剂

绿豆卵白：试验室自制；盐酸：中国医药上海化学试剂公司；碱性卵白酶(6000U/g)：Sigma试剂公司；氢氧化钠、DPPH、无水乙醇：以上均为合成纯，均购自天津市科密欧试剂有限公司。

二、主要仪器配置装备部署

紫外可见分光光度仪：上海舜宇恒平迷信仪器有限公司；电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗配置装备部署厂；详尽pH计：梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；恒温去世板箱：湘仪离神思仪器有限公司；电子天平(RSJ200—4)：湘仪离神思仪器有限公司；离神思(TDZ5一WS)：湘仪离神思仪器有限公司。

三、试验方式

（1）绿豆抗氧化肽的制备

将绿豆卵白配置装备部署成未必浓度的溶液，水浴加热至100℃妨碍15min均质解决。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中退出0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段光阴后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。

（2）DPPH从容基翦灭能耐的测定

参照于慧等人的方式妨碍DPPH从容基翦灭率的测定。将2mL未必浓度的绿豆多肽溶液以及2mL的0.12妹妹01·L^-1DPPH溶液妨碍搅浑，避光于25℃条件下反映30min，掏出后于517nm波长下妨碍吸光值的测定，此时吸光度值记实为A_i；将上述历程中的2mLDPPH溶液用无水乙醇取代，而后与2mL绿豆多肽溶液妨碍反映，此条件下测定吸光值记实为A_j，将2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液反映的条件作为空缺组，此时记实吸光值为Ao。
DPPH翦灭率合计公式如下：

A_i：样品组吸光度值；

A_j：比力组吸光度值；

A₀：空缺组吸光度值。

（3）单因素试验

本试验在于钻研酶法对于绿豆卵白水解的抗氧化肽的工艺优化，故以DPPH为指标，抉择酶解光阴、酶解温度、酶削减量以及pH为因素妨碍单因素试验。

①酶解温度对于绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、pH为九、酶解光阴3h作为牢靠条件，测定当酶解温度分说为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五个条件下时的DPPH翦灭率。

②酶浓度对于绿豆多肽抗氧化性的影响

将pH为九、酶解温度50℃、酶解光阴3h作为牢靠条件，测定当酶浓度分说为2％、4％、6％、8％、10％五个条件下时的DPPH翦灭率。

③pH对于绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、酶解温度50℃、酶解光阴3h作为牢靠条件，测定当pH分说为七、八、九、十、11五个条件下时的DPPH翦灭率。

④酶解光阴对于绿豆多肽抗氧化性的影响

将底物浓度为4％、pH为九、酶解温度50℃作为牢靠条件，测定当酶解光阴分说为0.5h、lh、2h、3h、4h五个条件下时的DPPH翦灭率。

（4）响应面优化妄想

经由单因素试验的服从，可能筛选出各因素的三个水平。以是在此根基之上，运用统计合成软件建树4因素3水平的Box—Behnken模子，妨碍回应面优化妄想。因素以及水平取值如表1所示。

二、服从与品评辩说

一、单因素试验服从

（1）绿豆多肽抗氧化性与酶解温度的关连

将绿豆卵白配置装备部署成未必浓度的溶液，水浴加热至100℃妨碍15min均质解决。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中退出0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段光阴后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。服从如图1所示。

由图1可知，当酶解温度低于50℃，DPPH翦灭率与温度成正比，当温度超过50℃时，DPPH翦灭率开始着落。这是因为卵白酶对于晃动的要求较高，温度过低会影响酶解的反映速率，使酶解反映不残缺，从而影响抗氧化肽的抗氧化成果。而温度过高则会影响卵白酶的活性，使卵白酶的活性着落，无奈使卵白水解成具备抗氧化性的小份子肽段，从而使DPPH翦灭率着落。

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