酶辅助超声提取阿尔泰金莲花总黄酮工艺钻研（一）

阿尔泰金莲花（Trolliusaltaicus），酶辅为毛茛科金莲花属多年生木本动物，助超钻研主要成长于我国新疆阿勒泰、声提塔城区域，尔泰性苦寒，金莲具备清热解毒、花总黄酮消炎杀菌、工艺止血止咳等成果，酶辅其去世板花蕾临床上多用于呼吸道熏染、助超钻研急慢性咽炎以及扁桃体炎等症状的声提治疗，当地民间也将其泡水饮用以防御伤风等疾病。尔泰可是金莲，作为商品金莲花的花总黄酮源头药材之一，该药材的工艺钻研报道较少。荭草素半乳糖苷等黄酮碳苷类化合物是酶辅该药材发挥药效的主要活性成份，并进一步品评辩说了其总黄酮的回流提取工艺。超声辅助提取是运用超声波的强烈的振动、空化、搅拌等效应破损动物细胞壁，增长实用成份溶于提取溶剂中。酶辅助超声提取法散漫了酶法以及超声提取法的短处，不光提取光阴短、提取功能高，且能较好地连结提取物的特色以及品质，现已经被宽泛运用于中草药活性成份的提取之中。本文拟经由审核酶制剂的种类、酶削减量、pH、料液比、提取光阴、提取温度以及提取功率对于其所含黄酮提取率的影响，进一步散漫Box-Behnken试验妄想以及响应面合成，优化阿尔泰金莲花总黄酮的最佳酶辅助超声提取工艺，为阿尔泰金莲花及其总黄酮的深度开辟提供参考数据。

一、资料与方式

一、资料与试剂

阿尔泰金莲花药材于2016年8月网络于新疆阿勒泰区域，经新疆药物钻研所何江副钻研员判断为阿尔泰金莲花T.altaicus的去世板花蕾，药材破碎捣毁，过40目筛。荭草素2-O-β-L-半乳糖苷比力品（OGA，上海源叶生物科技有限公司，品质分数98.0%，P31O7F23952）；纤维素酶:（4x10⁵U/g）、半纤维素酶（1x10⁵U/g）果胶酶（3x10⁵U/g）以及中性卵白酶（5x10⁵U/g）分说购自上海如吉生物科技发展有限公司；其余试剂均为国产合成纯。

二、仪器与配置装备部署

AS系列超声波洗涤机：天津欧特赛恩斯仪器有限公司；DZKW-S-4电热恒温水浴锅：北京市永黝黑医疗仪器有限公司；AL204型合终日平：梅特勒-托利多仪器有限公司，751型紫外可见分光光度计：上海英华科技仪器有限公司。

三、试验方式

（1）比力品溶液的配制及规范曲线绘制

详尽称取去世板至恒重的OGA比力品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%乙醇消融、稀释至刻度，摇匀、静置，患上0.20mg/mL的0GA比力品溶液，保存备用。分说详尽排汇比力品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分说置于25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，部署6min后，加10%硝酸铝溶液1.0mL，混匀部署6min后；再加4%氢氧化钠试液10.0mL，加水至刻度，摇匀部署15min，以响应试剂为空缺，在500nm处测定吸光度（A），以A为纵坐标，品质浓度（C）为横坐标绘制规范曲线，患上回归方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL畛域内有优异的线性关连关连。

（2）样品溶液制备及其总黄酮测定

称取未必量阿尔泰金莲花，再分说向其中削减区别体积区别浓度的乙醇，退出酶，在未必温度下分说超声解决确守光阴，制患上供试样品溶液。详尽称取去世板至恒重的OGA比力品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%乙醇消融、稀释至刻度，摇匀、静置，患上0.20mg/mL的0GA比力品溶液，保存备用。分说详尽排汇比力品溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL分说置于25mL容量瓶中，各加水至8.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，部署6min后，加10%硝酸铝溶液1.0mL，混匀部署6min后；再加4%氢氧化钠试液10.0mL，加水至刻度，摇匀部署15min，以响应试剂为空缺，在500nm处测定吸光度（A），以A为纵坐标，品质浓度（C）为横坐标绘制规范曲线，患上回归方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL畛域内有优异的线性关连关连。并合计提取率。阿尔泰金莲花总黄酮提取率Y（%）=（C×V/M）x100%，式中：C为提取液中黄酮浓度（mg/mL），V为提取液体积（mL），M为药材品质（mg）。

（3）酶制剂的抉择

称取1.0g阿尔泰金莲花多少多份，分说向其中退出占药材品质1.0%的纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、中性卵白酶，将一份未加任何酶制剂的样品作比力组。每一份样品分说加50倍量50%乙醇，退出盐酸缓冲液，调pH分说设定三、四、五、6，将上述各组样品于40℃，超声功率90W下超声提取30min酶解后，各组样品经灭酶（滚水浴5min），过滤患上到上清液。分说从各组中取过多提取液，合计金莲花总黄酮提取率。

（4）单因素试验

称取药材1.0g，分说对于超声酶辅助提取工艺中的影响因素（酶削减量、料液比、提取温度、提取光阴、超声功率）妨碍审核。酶削减量:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；料液比：1:十、1:20、1:30、1:40、1:50；乙醇浓度：30%、40%、50%、60%、70%；提取温度：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃；提取光阴：10min、20min、30min、40min、50min；超声功率：90W、132W、174W、216W、258W、300W。

（5）响应面试验妄想

依据Box-Behnken中间组合道理，在单因素试验服从的根基上，抉择酶削减量、乙醇浓度、提取光阴以及提取温度四个因素为自变量，每一自变量的试验分说以-一、0、1编码，以总黄酮提取率（%）为响应值，妨碍四因素三水平试验，运用Design-Expert8.05软件对于试验多元线性回归以及二项式拟合，并对于拟合方程妨碍方差合成。因素水平妄想见表1。

二、服从与合成

一、酶制剂的筛选

区别酶制剂在区别pH条件下，所患上总黄酮提取率也不相同。随着pH的削减，在种种酶制剂浸染下，阿尔泰金莲花总黄酮提取率均泛起初削减后着落的趋势。从图1可能看出，纤维酶在pH即是4时浸染最佳，其提取率可能达到17.09%，大于中性卵白酶、半纤维素酶、果胶酶、无酶浸染下的提取率。原液的pH为6.5，因此从提取率思考，改动溶液的pH为4，且抉择纤维素酶妨碍下一步试验。

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