肠道汇聚性大肠埃希氏菌菌体以及gDNA规范物资的研制 （一）

指标：为知足肠道汇聚性大肠埃希氏菌精确检测的肠道肠埃试验室品质操作以及能耐验证需要，研制具备我国自主常识产权且具备全基因组测序信息的汇聚平均晃动的肠道汇聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA规范物资。方式：运用二代高通量测序技术对于肠道汇聚性大肠埃希氏菌（CMCC44841）妨碍全基因组测序，性大希氏清晰CMCC44841的菌菌种属、血清分型、体及多位点序列分型以及毒力基因。规范对于CMCC44841妨碍astA、物资aggR、肠道肠埃pic特色性基因PCR确认。汇聚接管冷冻去世板技术制备含量为103CFU/样品的性大希氏菌球以及含量为20ng/样品的gDNA小球。参照CNAS-GL017对于20个菌球样品妨碍平均性魔难，菌菌接管单因素方差合成对于服从妨碍统计合成。体及将样品分说于-20℃、规范4℃、物资25℃以及37℃条件下收藏，肠道肠埃对于其蕴藏晃动性以及运输晃动性妨碍评估。机关3家试验室妨碍协同标定以及验证。运用5种区别基质的即食食物样本，遵照国标法魔难规范物资的适用性。服从：运用生物信息学合成，CMCC44841基因组巨细为5.057285Mb，GC含量为50.6%，编码区基因5173个。种属判断服从为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli），血清预料服从为O127:H21，MLST为ST40型，照料除了aggR、astA、pic之外其余相干的毒力基因。PCR扩增出astA、aggR、pic片断巨细分说为102bp、400bp以及1111bp。菌体规范物资平均性魔难服从F=1.59，适宜规范物资的要求。菌体以及gDNA规范物资样品于-20℃以及4℃收藏60d，25℃收藏7d，37℃收藏5d后依然晃动。经3家试验室协同标定，菌体规范物资样品含量均为103CFU/样品。20件区别基质的食物样品退出肠道汇聚性大肠埃希氏菌规范物资妨碍魔难，都可能检出。论断：本钻研所制备的肠道汇聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA规范物资所用菌株源头于我国国内别离菌株，且具备清晰的全基因组序列信息，平均性以及晃动性均适宜要求，适用性优异，可能知足食物检测试验室的品质操作以及能耐验证的需要。

致泻性大肠埃希氏菌所引起的腹泻是天下畛域内存在的一个紧张的公共卫生成果。依据毒力因子、致病机理以及盛行病学特色，致泻性大肠埃希氏菌可分为5类：肠道致病性大肠埃希氏菌（enteropathogenic Escherichiacoli,EPEC）、肠道产毒性大肠埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC）、肠道出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagic Escherichiacoli,EHEC）、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（enteroinvasive Escherichiacoli,EIEC）以及肠道汇聚性大肠埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichiacoli,EAEC）。EAEC是一类新发现的致泻性大肠埃希氏菌，已经谢世界列国引起散发或者发生。美国国立卫生钻研院已经将EAEC归为B类生物无畏病原体。我国各省市致泻大肠埃希氏菌盛行特色合乐成果呈现，EAEC在食源性致泻大肠埃希氏菌中最罕有，为主要毒力基因型。因此食物中EAEC快捷精确的检测使命对于防御以及操作由其引起的细菌性食物中毒事件有着十分紧张的浸染。

EAEC传统的判断方式包罗别离作育、生化判断、血清学判断以及16SrDNA判断等，这些方式试验周期较长，且存在未必的规模性。当初PCR技术因为其灵便度高坚贞性强等短处被宽泛运用于EAEC的检测中。国家规范GB4789.6-2016规定对于生化反映适宜大肠埃希氏菌特色的菌落妨碍汇聚热晃动性毒素A基因（enteroag gregative heat-stable enter otoxin A,astA）、汇聚黏附菌毛调节基因（aggregative adhesive fimbriaere gulator,aggR）、肠定植因子基因（proteininvolve dinintestinal colonization,pic）三个特色性基因的PCR判断，每一次PCR反映需要运用EAEC规范菌株及其gDNA作为阴性比力，以保障服从的精确性。因为重大的食物基质布景、作育基、试剂、DNA提取、职员操作等原因可间接影响检测服从的精确性，以是在检测历程中需要晃动的微生物规范物资以及DNA规范物资对于全部魔难历程妨碍品质操作，从而保障检测数据的精确性以及实用性。当初国内对于EAEC菌体规范物资及其基因组DNA（genomic DNA，gDNA）规范物资并未见相干的钻研报道。

自21世纪初，基因测序技术取患上突破性妨碍，基因测序取患上的数据量、测序速率以及用度都患上到大幅度变换。在国内，单个微生物基因组测序的用度也从数万元着落至当初多少百元。经由对于食源性微生物基因组妨碍测序、组装，可能取患上90%以上的细菌DNA信息，包罗种属、耐药基因、毒力因子、转移元件等信息，可对于多个细菌间的基因组信息妨碍比对于合成，在细菌判断、耐药机制以及溯源等钻研中发挥紧张的浸染。

本钻研针对于当初魔难畛域需要，运用高通量测序技术对于肠道汇聚性大肠埃希氏菌CMCC44841妨碍全基因组测序，研制基因组信息布景清晰、晃动性优异的即用型肠道汇聚性大肠埃希氏菌菌体以及gDNA两种规范物资，不光可能运用于食物检测机构的品质操作以及职员审核，而且可为我国食物牢靠检测水平进一步普及、实时发现成果提供有力的技术反对于。

1资料与方式

1.1资料与试剂

肠道汇聚性大肠埃希氏菌（EAEC）CMCC44841源头于中国医学细菌收藏打点中间。

胰卵白胨大豆琼脂（tryptosesoyaagar,TSA）美国BD公司；心理盐水国药总体；细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP日本Takara；琼脂糖Oxoid。

1.2仪器与配置装备部署

FreeZone12L冷冻去世板机德国LABCONCO公司；PL2002电子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Thermo1389生物牢靠柜、205050GC恒温作育箱、冷冻离神思、NanoDrop2000微量核酸卵白测定仪、Qubit荧光定量测定仪美国Thermo公司；FORMA恒温摇床西班牙IUL公司；VITEKCompact2被动微生物合成系统法国梅里埃公司；Autoflex飞翔质谱德国Bruker公司；C1000PCR仪、紫外凝胶成像系统美国伯乐公司。

相干链接：大肠埃希氏菌，毒素，聚合酶，规范物资

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